用于酶促合成多核苷酸的方法和设备技术

本发明专利技术涉及使用具有序列依赖性偶联效率的无模板聚合酶在反应室阵列中平行酶促合成多核苷酸的方法和设备。每当在合成多核苷酸的生长链的3

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于酶促合成多核苷酸的方法和设备
[0001]最近对多核苷酸合成的酶促方法的兴趣增加，这不仅是因为许多领域，如合成生物学、CRISPR
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Cas9应用和高通量测序对合成多核苷酸的需求增加，而且还因为多核苷酸合成的化学方法的局限性，如产物长度的上限以及有机溶剂的使用和需要处置，Jensen等人,Biochemistry,57:1821
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1832(2018)。酶促合成因其特异性和效率以及由于其使用消除了处理有害废物的需要的温和的水性反应条件而具有吸引力。
[0002]目前，大多数酶促方法采用无模板聚合酶将3
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O封闭的核苷三磷酸重复添加到连接至支持物的单链引发剂或延长链上，然后去封闭，直到获得所需序列的多核苷酸。然而，不幸的是，无模板聚合酶通常在其偶联产率上具有序列特异性的低效率。也就是说，在给定的一组反应条件和时间下，发生核苷酸偶联的生长链3
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端处的序列可能会影响偶联效率。每当相同的反应时间用于所有反应室时，这使得在平行合成操作中难以或不可能获得一致的产物产率。
[0003]鉴于上述情况，如果可获得能够使由于序列特异性偶联低效导致的产物产量差异最小化的方法和设备，则使用无模板聚合酶平行合成多核苷酸将得到推进。专利技术概述
[0004]本专利技术涉及用于在单独的反应室中平行合成多个多核苷酸的方法和装置，包括微流体装置。更特别地，本专利技术涉及利用无模板聚合酶合成各自具有预定序列的多个多核苷酸的方法，其中所述无模板聚合酶在一个或多个低效率基序处具有降低的偶联效率，所述方法包括以下步骤：(a)为所述多个核苷酸中的每个多核苷酸提供反应室，每个反应室具有设置在其中的连接有引发剂的合成支持物，其中每种引发剂具有游离的3
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羟基，并且其中每个反应室具有入口和出口以及过滤器，所述过滤器保留所述合成支持物并在操作上与所述出口关联，使得离开所述反应室的反应溶液通过所述过滤器；(b)提供在操作上与所述反应室的出口关联的废物歧管，使得每当在所述反应室与所述废物歧管之间产生正压差时，从所述反应室中去除反应溶液；(c)对每个反应室重复以下反应步骤的循环，直到此类反应室的多核苷酸完成：(i)在偶联溶液中使所述引发剂或去保护的延长片段与3
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保护的核苷三磷酸和无模板聚合酶接触，使得通过所述3
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保护的核苷三磷酸延长引发剂或去保护的延长片段，以形成3
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保护的延长片段，(ii)利用去保护溶液对所述3
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保护的延长片段去保护，以及(iii)在所述反应室和所述废物歧管之间施加压差，以从所述反应室中去除溶液；其中通过所述反应室的多核苷酸序列确定在反应室中步骤(i)中接触的3
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保护的核苷三磷酸的种类，以及其中，每当在此类反应室的去保护的延长片段的3
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端处存在低效率基序时，在每个循环之前，在反应室中进行步骤(i)的一个或多个短循环。如下文更完整解释的，效率基序是在延长片段的3
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端处的序列区段，其导致无模板聚合酶在将核苷酸单体偶联至延长片段方面具有降低的效率。在一些实施方案中，无模板聚合酶包括末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)。在采用本文公开的TdT的一些实施方案中，低效率基序包括选自包括CCA、CTA、GCA、GTA和CCT的集合的3
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mer序列。在其他实施方案中，此类集合包括CCA和CTA。在其他实施方案中，鉴定了无模板聚合酶的低效率基序，例如，如下文所述，使得可以实施本专利技术的
方法和设备。本专利技术还涉及利用无模板聚合酶合成各自具有预定序列的多个多核苷酸的设备，其中所述无模板聚合酶在一个或多个低效率基序处具有降低的偶联效率，所述设备包括：(a)多个反应室，每个反应室具有设置在其中的连接有引发剂的合成支持物，其中每种引发剂具有游离的3
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羟基，并且其中每个反应室具有入口和出口以及过滤器，所述过滤器保留所述合成支持物并在操作上与所述出口关联，使得离开所述反应室的反应溶液通过所述过滤器；(b)废物歧管，其在操作上与所述反应室的出口关联，使得每当在所述反应室和所述废物歧管之间建立正压差时，反应溶液从所述反应室中去除并进入所述废物歧管；(c)流体输送系统，其用于将反应溶液输送至所述阵列的反应室中；(d)用户界面，其用于接受要合成的多核苷酸的核苷酸序列和低效率基序数据；(e)在操作上与所述用户界面、所述多个反应室、所述流体输送系统和所述废物歧管关联的控制系统，其中所述控制系统确定每个多核苷酸的每个低效率基序的数量和位置，并将每个多核苷酸分配至反应室以进行合成，并且其中对于每个反应室，直到其多核苷酸完成，所述控制系统指导以下重复步骤：(i)在偶联条件下，将偶联溶液输送至所述引发剂寡核苷酸或去保护的延长片段，所述偶联溶液含有3
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保护的核苷三磷酸和无模板聚合酶，以允许通过所述3
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保护的核苷三磷酸延长引发剂寡核苷酸或去保护的延长片段，来形成3
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保护的延长片段，(ii)向所述反应室输送去保护溶液，使得所述3
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保护的延长片段去保护，以及(iii)在所述反应室和所述废物歧管之间产生压差，以从所述反应室中去除偶联和/或去保护溶液；其中通过所述反应室的预定序列确定在反应室中步骤(i)中接触的3
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保护的核苷三磷酸的种类，以及其中，每当在此类反应室的去保护的延长片段的3
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端处存在低效率基序时，在每个循环之前，在反应室中进行步骤(i)的一个或多个短循环。
[0005]如上，在本专利技术设备的一些实施方案中，无模板聚合酶包括末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)。在采用本文公开的TdT的其他实施方案中，低效率基序包括选自包括CCA、CTA、GCA、GTA和CCT的集合的3
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mer序列。在其他实施方案中，此类集合包括CCA和CTA。
[0006]本专利技术的设备特别适合于实施利用无模板聚合酶合成各自具有预定序列的多个多核苷酸的方法，其中所述无模板聚合酶在本专利技术的一个或多个低效率基序处具有降低的偶联效率。本专利技术还涉及利用无模板聚合酶合成各自具有预定序列的多个多核苷酸的试剂盒，其包含本专利技术的设备和3
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保护的核苷三磷酸和/或无模板聚合酶和/或偶联溶液和/或去保护溶液。
[0007]在许多所示的实施方式和应用中举例说明本专利技术的这些上文表征的方面以及其他方面，其中一些在附图中示出并且在随后的权利要求部分中表征。然而，以上概述并非旨在描述本专利技术的每个所示实施方案或每个实施方式。附图的简要说明
[0008]图1示出了酶促合成多核苷酸的基本步骤。
[0009]图2A示出了反应孔的阵列，例如，每个反应孔具有用于去除反应流体的出口，并且为输送试剂的目的，每个是可寻址的。
[0010]图2B示出了可以在图2A的反应孔中平行合成的多核苷酸的给定选择，显示了针对每个多核苷酸而言低效率基序的出现，引本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.利用无模板聚合酶合成各自具有预定序列的多个多核苷酸的方法，其中所述无模板聚合酶在一个或多个低效率基序处具有降低的偶联效率，所述方法包括以下步骤：(a)为所述多个核苷酸中的每个多核苷酸提供反应室，每个反应室具有设置在其中的连接有引发剂的合成支持物，其中每种引发剂具有游离的3
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羟基，并且其中每个反应室具有入口和出口以及过滤器，所述过滤器保留所述合成支持物并在操作上与所述出口关联，使得离开所述反应室的反应溶液通过所述过滤器；(b)提供在操作上与所述反应室的出口关联的废物歧管，使得每当在所述反应室与所述废物歧管之间产生正压差时，从所述反应室中去除反应溶液；(c)对每个反应室重复以下反应步骤的循环，直到此类反应室的多核苷酸完成：(i)在偶联溶液中使所述引发剂或去保护的延长片段与3
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保护的核苷三磷酸和无模板聚合酶接触，使得通过所述3
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保护的核苷三磷酸延长引发剂或去保护的延长片段，以形成3
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保护的延长片段，(ii)利用去保护溶液对所述3
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保护的延长片段去保护，以及(iii)在所述反应室和所述废物歧管之间施加压差，以从所述反应室中去除反应溶液；其中通过所述反应室的多核苷酸序列确定在反应室中步骤(i)中接触的3
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保护的核苷三磷酸的种类，以及其中，每当在此类反应室的去保护的延长片段的3
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端处存在低效率基序时，在每个循环之前，在反应室中进行步骤(i)的一个或多个短循环。2.如权利要求1所述的方法，其中所述循环和所述短循环具有相同的持续时间。3.如权利要求1或2所述的方法，其还包括从所述合成支持物切割所述多核苷酸的步骤。4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述无模板聚合酶是末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)。5.如权利要求4所述的方法，其中所述低效率基序是CCA、CTA、GCA、GTA或CCT。6.如权利要求4或5所述的方法，其中所述TdT是具有与SEQ ID NO:16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30至少90％相同的氨基酸序列的TdT变体，其中SEQ ID No:16、17、18、19和20的氨基酸序列各自具有取代Q4E/S/D/N，并且其中所述TdT变体(i)能够在没有模板的情况下合成核酸片段，以及(ii)能够在多核苷酸的游离的3
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羟基上掺入3
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O保护的核苷酸。7.利用无模板聚合酶合成各自具有预定序列的多个多核苷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：阿德里安，
申请(专利权)人：DNA斯克瑞普特公司，
类型：发明
国别省市：