一种异质性耐药细菌中碱基杂合的检测方法技术

本发明专利技术属于细菌基因检测技术领域，公开了一种异质性耐药细菌中碱基杂合的检测方法，对二代测序发现的phoP

【技术实现步骤摘要】
一种异质性耐药细菌中碱基杂合的检测方法


[0001]本专利技术属于细菌基因检测
，尤其涉及一种异质性耐药细菌中碱基杂合的检测方法。

技术介绍

[0002]异质性耐药(Heteroresistance,HR)因其普遍性，难以检测和治疗困难等特征给临床感染控制带来极大挑战。HR是细菌耐药的一种特殊类型，指同一细菌群体在抗菌药敏感性方面表现出表型的不同，其中部分亚群的最低抑菌浓度(MIC)高于细菌的主要菌群。HR在多种不同的细菌种类和抗菌药物类别中十分普遍且其耐药表型复杂。其主要敏感亚群中存在少部分耐药亚群，通常HR菌株在抗菌药物存在时，耐药亚群富集，但没有抗菌药物压力时，容易迅速恢复敏感。这是HR区别于我们熟知的经典耐药的一个重要特点，这也导致体外药敏检测通常将其判断为敏感细菌而影响临床抗菌药物的初始选择。异质性耐药成因和表象复杂且具有临床意义，其分子机制研究是细菌耐药基础研究的一个前沿方向。
[0003]目前，针对细菌开展的二代全基因组测序可以检测发生在基因组中的基因突变、丢失、插入等。但是普通的二代全基因组测序深度一般为500
×
以内，仅分析基因组序列可能会遗漏同一位点发生率在10
‑3及以下频率的不同碱基杂合现象，而不能发现杂合形成的遗传学差距。
[0004]通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：普通的二代全基因组测序方法中，仅分析基因组序列可能会遗漏同一位点发生率在10
‑3及以下频率的不同碱基杂合现象，而不能发现杂合形成的遗传学差距。
专利技术内容
[0005]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种异质性耐药细菌中碱基杂合的检测方法。
[0006]本专利技术是这样实现的，一种异质性耐药细菌中碱基杂合的检测方法，所述异质性耐药细菌中碱基杂合的检测方法包括：对二代测序发现的phoP
‑
phoQ基因突变位点的两端设计引物，进行高保真PCR产物扩增，然后将包含phoP
‑
phoQ基因突变位点的PCR产物进行500万(106)
×
超深度二代测序；
[0007]针对phoP
‑
phoQ基因特定位点进行超深度测序方法，检测细菌单克隆中phoP
‑
phoQ基因的同一个位点存在的碱基杂合，从而确定异质性耐药机制。
[0008]进一步，所述基因还包括其他任何试图检测的目的基因，例如mgrB,tolC,arnA等基因。
[0009]进一步，所述异质性耐药细菌中碱基杂合的检测方法包括以下步骤：
[0010]步骤一，对二代测序发现的phoP
‑
phoQ基因突变位点的两端设计引物；
[0011]本专利技术针对不同菌株的phoP
‑
phoQ基因的不同突变位点两端分别在primer3网站上设计以下引物：引物设计具体步骤如下：
[0012]一：打开“Primer3 Input 0.4.0”站点(https://bioinfo.ut.ee/primer3
‑
0.4.0/)。
[0013]二：粘贴模板序列。在“Paste source sequence below(5'
‑
>3'
…”
下面的大空框里粘贴模板序列。
[0014]三：重要参数设定。设置“Product Size Ranges”为250
‑
300，其他均为默认值。
[0015]四：点击Pickprimers，得到符合大小预期的primer。
[0016]五：引物设计检验：使用OligoCalc在线网站(http://biotools.nubic.northwestern.edu/OligoCalc.html)检验引物的GC含量、TM值、发夹结构等；择优选取合适引物。
[0017]PCR引物：由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成，具体序列见(表2)
[0018]表2：深度测序引物表
[0019][0020]步骤二，进行高保真PCR产物扩增；
[0021]1、PCR反应体系(25μl)：
[0022][0023]2、PCR反应条件：
[0024][0025]变性
‑
退火
‑
延伸共30个循环
[0026]再延伸72℃5min
[0027]3、最终扩增得到的PCR产物序列:
[0028][0029]步骤三，将包含phoP
‑
phoQ基因突变位点的PCR产物进行500万
×
超深度二代测序。
[0030]PCR产物测序步骤：DNA检测、文库构建、文库质量检测、上机测序、质量控制。
[0031]加深测序深度，使Reads数量达到500万级别，从而实现超深度二代测序。
[0032]进一步，所述步骤一中的PCR产物长度为300bp左右。
[0033]进一步，所述步骤二中的超深度二代测序约为5
×
106。
[0034]结合上述的技术方案和解决的技术问题，请从以下几方面分析本专利技术所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
[0035]第一、针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本专利技术的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本专利技术技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：
[0036]本专利技术针对特定的基因突变位点两端通过PCR扩增，对得到的PCR产物进行超深度测序，具有靶向性、特异性和高灵敏度。提供了一种具体的可操作的能够检测细菌基因组10
‑3及以下频率的不同碱基杂合的方法和流程，能够精准高效地发现碱基杂合形成的遗传学差距，从遗传学层面阐释细菌单克隆异质性耐药的机制。
[0037]第二，把技术方案看做一个整体或者从产品的角度，本专利技术所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：
[0038]本专利技术创新地开展了一种针对phoP
‑
phoQ(或者其他目的基因)超深度测序方法。本专利技术通过这样的超深度测序，可以准确检测细菌单克隆中phoP
‑
phoQ基因的同一个位点存在的碱基杂合，从而阐释异质性耐药机制。
[0039]第三，作为本专利技术的权利要求的创造性辅助证据，还体现在以下几个重要方面：
[0040](1)本专利技术的技术方案填补了国内外业内技术空白：目前针对细菌开展的二代全基因组测序可以检测发生在基因组中的基因突变、丢失、插入等。但是普通的二代全基因组测序深度一般为500
×
以内，仅分析基因组序列可能会遗漏同一位点发生率在10
‑3及以下频率的不同碱基杂合现象，而不能发现杂合形成的遗传学差距。本专利技术创新地开展了一种针对phoP
‑
phoQ(或者其他目的基因，本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种异质性耐药细菌中碱基杂合的检测方法，其特征在于，所述异质性耐药细菌中碱基杂合的检测方法对二代测序发现的phoP
‑
phoQ基因突变位点的两端设计引物，进行高保真PCR产物扩增，然后将包含phoP
‑
phoQ基因突变位点的PCR产物进行500万(106)
×
超深度二代测序；包括：利用针对phoP
‑
phoQ超深度测序方法，检测细菌单克隆中phoP
‑
phoQ基因的同一个位点存在的碱基杂合，从而确定异质性耐药机制。2.如权利要求1所述异质性耐药细菌中碱基杂合的检测方法，其特征在于，所述基因还包括其他目的基因。3.如权利要求1所述异质性耐药细菌中碱基杂合的检测方法，其特征在于，所述异质性耐药细菌中碱基杂合的检测方法包括以下步骤：步骤一，对二代测序发现的phoP
‑
phoQ基因突变位点的两端设计引物；步骤二，进行高保真PCR产物扩增；步骤三，将...

【专利技术属性】
技术研发人员：王成成，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：