一种恒温快速检测阪崎克罗诺杆菌的引物组合物、试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术属于阪崎克罗诺杆检测技术领域，具体涉及一种恒温快速检测阪崎克罗诺杆菌的引物组合物、试剂盒及应用。本申请公开的一种恒温快速检测阪崎克罗诺杆菌的引物组合物，包括RPA引物组以及PCR的引物组，具体为正向引物RPA

【技术实现步骤摘要】
一种恒温快速检测阪崎克罗诺杆菌的引物组合物、试剂盒及应用


[0001]本专利技术属于阪崎克罗诺杆检测
，具体涉及一种恒温快速检测阪崎克罗诺杆菌的引物组合物、试剂盒及应用。

技术介绍

[0002]婴儿配方奶粉(PIF)是作为除母乳之外，婴幼儿这一特殊人群的主要膳食营养来源，其产品的卫生安全与婴幼儿的健康息息相关，对社会的稳定和发展有着密不可分的关系。由于婴儿缺乏发达的免疫系统或竞争性肠道菌群，因此婴儿食品的微生物学安全性非常重要。
[0003]而阪崎克罗诺杆菌(C.sakazakii)是PIF中最为常见和频发的致病菌，可导致罕见的危及新生儿生命的脑膜炎、败血症和坏死性小肠结肠炎。在婴儿配方奶粉食品安全的检测中，世界各国将C.sakazakii列为必须检测的微生物指标之一。
[0004]当前传统的C.sakazakii检测方法步骤繁琐、耗时费力，需要经过从培养富集到血清型鉴定等一系列冗长的步骤，整个过程需要耗时4
‑
7天。而使用最为广泛的PCR技术虽然具备高效、特异、灵敏的优点，但由于其对复杂的热循环设备的要求和进行扩增所必需的精确温度控制导致PCR被局限在实验室的使用范围内，从而限制了它在资源匮乏的环境中的应用。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的PCR技术被局限在实验室的使用范围内，从而限制了它在资源匮乏的环境中的应用的技术问题，提供一种恒温快速检测阪崎克罗诺杆菌的引物组合物、试剂盒及应用。
[0006]本专利技术的引物组合物构建的试剂盒，运用于对婴儿配方奶粉质量安全的检测，能够快速确定婴儿配方奶粉中是否含有阪崎克罗诺杆菌。
[0007]为了实现本专利技术的上述目的，本专利技术采用以下技术方案，
[0008]一种恒温快速检测阪崎克罗诺杆菌的引物组合物，包括：
[0009]RPA引物组以及PCR的引物组；其中
[0010]RPA引物组：
[0011]正向引物RPA
‑
F：TGGAAGCGGGATGACGTGACCGGCCAGTATTT
[0012]反向引物RPA
‑
R：TTATCAAGCCACCAGCGCATCATGTCGTAG
[0013]探针：
[0014]CATGCACCTGTTCAGCAGCCGTCAGCCCGA(FAM
‑
dT)(THF)(BHQ1
‑
d
[0015]CAACTGGGAAAATCA
‑
SpacerC3。
[0016]进一步的，所述PCR的引物组，
[0017]PCR
‑
F:GCCGAACCCCGAAAAACT
[0018]PCR
‑
R:TGCCAGGCGGTGAAAATG
[0019]更进一步的，所述所述PCR的引物组，目的片段大小为288bp。
[0020]进一步的，所述RPA引物组，目的片段大小为128bp。
[0021]同样的，本专利技术也提供了一种恒温快速检测阪崎克罗诺杆菌的试剂盒，包括上述的引物组合物；
[0022]一种恒温快速检测阪崎克罗诺杆菌的试剂盒的应用，用于检测婴儿配方奶粉是否含有阪崎克罗诺杆菌，具体应用过程，包括以下步骤：
[0023]S1.引物与探针的设计
[0024]根据C.sakazakii的gluA基因设计所需的RPA引物组和PCR的引物组；
[0025]S2.建立实时荧光RPA反应体系和qPCR反应体系
[0026]使用TwistAmp exo试剂盒以50μL的体积进行实时RPA反应；其他成分包括每个420nM引物、120nM探针、14mM乙酸镁、2μLDNA模板、无核酸酶水以及荧光基础缓冲液。
[0027]本技术方案与
技术介绍
相比，至少具有如下优点：
[0028]1.本试剂盒建立的real
‑
time RPA(实时荧光重组酶聚合酶扩增)技术只需在37℃下15min之内就能得到检测结果，检测设备小巧且易于携带，为现场以及资源匮乏的地方提供更加方便的检测手段。
[0029]2.该试剂盒的检测灵敏度是qPCR的10倍，同时反应速度比qPCR更迅速。
具体实施方式
[0030]现有技术中存在的PCR技术被局限在实验室的使用范围内，从而限制了它在资源匮乏的环境中的应用的技术问题。
[0031]为此，本专利技术提供一种恒温快速检测阪崎克罗诺杆菌的引物组合物、试剂盒及应用，以解决上述技术问题。
[0032]为了使本专利技术的目的、特征和优点更加的清晰，以下结合更具体的实施例，对本专利技术的具体实施方式做出更为详细的说明，在下面的描述中，阐述了很多具体的细节以便于充分的理解本专利技术，但是本专利技术能够以很多不同于描述的其他方式来实施。因此，本专利技术不受以下公开的具体实施的限制。
[0033]实施例1
[0034]一种恒温快速检测阪崎克罗诺杆菌的试剂盒，具有制备和使用过程，如下所述：
[0035]S1.引物与探针的设计：根据C.sakazakii的gluA基因设计所需的引物和探针
[0036]RPA引物组，目的片段大小为128bp
[0037]正向引物RPA
‑
F：TGGAAGCGGGATGACGTGACCGGCCAGTATTT
[0038]反向引物RPA
‑
R：TTATCAAGCCACCAGCGCATCATGTCGTAG
[0039]探针：
[0040]CATGCACCTGTTCAGCAGCCGTCAGCCCGA(FAM
‑
dT)(THF)(BHQ1
‑
d
[0041]CAACTGGGAAAATCA
‑
SpacerC3
[0042]PCR的引物组，目的片段大小为288bp：
[0043]PCR
‑
F:GCCGAACCCCGAAAAACT
[0044]PCR
‑
R:TGCCAGGCGGTGAAAATG
[0045]S2.建立实时荧光RPA反应体系和qPCR反应体系
[0046]使用TwistAmp exo试剂盒(TwistDX，英国剑桥)以50μL的体积进行实时RPA反应。其他成分包括每个420nM引物、120nM探针、14mM乙酸镁、2μLDNA模板、无核酸酶水以及荧光基础缓冲液。除模板DNA和乙酸镁外，所有试剂均在预混管中制备。随后，将2μL模板DNA和醋酸镁添加到每个反应管中。然后将反应管放置在带有微型光学检测器(QT
‑
RAA
‑
F1620，江苏奇天生物技术有限公司)的荧光分析仪中，在37℃下反应15min。具体每个反应管包括：
[0047][0048][0049]qPCR检测采用SYBRGreen法，总反应体积为20μL本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种恒温快速检测阪崎克罗诺杆菌的引物组合物，其特征在于，包括：RPA引物组以及PCR的引物组；RPA引物组：正向引物RPA
‑
F：TGGAAGCGGGATGACGTGACCGGCCAGTATTT反向引物RPA
‑
R：TTATCAAGCCACCAGCGCATCATGTCGTAG探针：CATGCACCTGTTCAGCAGCCGTCAGCCCGA(FAM
‑
dT)(THF)(BHQ1
‑
dCAACTGGGAAAATCA
‑
SpacerC3。2.根据权利要求1所述的一种恒温快速检测阪崎克罗诺杆菌的引物组合物，其特征在于，所述PCR的引物组：PCR
‑
F:GCCGAACCCCGAAAAACTPCR
‑
R:TGCCAGGCGGTGAAAATG。3.根据权利要求2所述的一种恒温快速检测阪崎克罗诺杆菌的引物...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪晗露，雷洋，汪大明，白佳委，
申请(专利权)人：厦门健康工程与创新研究院，
类型：发明
国别省市：