一种L-苏氨酸醛缩酶突变体以及在L-丝氨酸合成中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种L

【技术实现步骤摘要】
一种L
‑
苏氨酸醛缩酶突变体以及在L
‑
丝氨酸合成中的应用


[0001]本专利技术涉及生物工程
，更具体地涉及一种L
‑
苏氨酸醛缩酶突变体以及在L
‑
丝氨酸合成中的应用。

技术介绍

[0002]L
‑
丝氨酸又名L
‑2‑
氨基
‑3‑
羟基丙酸，其在生物体内处于氨基酸代谢的中间位置，具有许多重要的生理作用。其可以用来合成多种氨基酸、核酸碱基以及磷脂等物质。目前普遍应用于医药、食品以及化妆品等领域，例如，在医药领域中，L
‑
丝氨酸可以用来配置复方氨基酸输液以及作为营养增补剂，同时它也在稳定肝脏血糖浓度方面起着重要作用。L
‑
丝氨酸常常添加在高级化妆品中以提高化妆品的保湿性，其还具有一定的抗菌和表面活性剂的作用。此外，L
‑
丝氨酸可以和糖类在高温下发生美拉德反应使食物产生特殊的香味。同时其多种衍生物也具有很多重要的功能，例如环丝氨酸可以用来治疗结核病，偶氮丝氨酸可以用来治疗肿瘤以及急性白血病和柯杰金氏病。
[0003]L
‑
丝氨酸的生产方法有多种，包括化学合成法、蛋白质水解法、发酵法以及生物酶法。化学合成法的缺点主要是反应步骤繁琐，还需要进行多步纯化才能获得光学纯的手性L
‑
丝氨酸。蛋白质水解法过程较为繁琐，水解终点难以准确判断，L
‑
丝氨酸损失率较高，同时对环境污染严重。当下L<br/>‑
丝氨酸的生产方法主要是前体发酵法，但此方法后续分离困难从而导致成本较高，同时对生产设备也有较高的要求。与以上三种方法相比较而言，生物酶法具有反应条件温和、立体选择性高和环境友好等优点，已广泛用于医药中间体、精细化学品等手性化学品的工业生产中。目前，L
‑
丝氨酸生物合成涉及到的酶主要为丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)，它催化过程相对复杂，不仅需要PLP作为辅酶，还需要四氢叶酸的存在才能催化反应生成L
‑
丝氨酸，导致后续分离纯化成本的增加。因此，仍需要寻求一个能够相对简单高效生产L
‑
丝氨酸的方法。
[0004]魏江筛选出了一种新的利用甲醇的海洋细菌菌株Shewanella algae，显示出高SHMT活性。将该SHMT基因成功克隆至大肠杆菌(DE3)中进行表达，并对其酶学性质和催化活性进行了研究，发现该酶可以转化产生77.76mM的L
‑
丝氨酸。Hsiao H Y采用Klebsiella aerogenes GX1705(pGX 2236)重组菌株表达的SHMT的粗提物形式，研究了甘氨酸和甲醛(HCHO)生产L
‑
丝氨酸的过程。通过仔细平衡甲醛进料速率与酶促生物转化速率，在保持甲醛浓度处于较低水平的条件下，丝氨酸总产率可以达到5.2g/L/h。最近，山东大学的马翠卿团队设计了一种体外酶级联反应，用于从甘油生产L
‑
丝氨酸，涉及到的酶包括醛糖醇氧化酶、D
‑
乳酸脱氢酶、L
‑
丙氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶以及过氧化氢酶。在优化各个酶的投量后，以18.51mM甘油制备了17.58mM L
‑
丝氨酸。
[0005]苏氨酸醛缩酶(TA)是一种依赖5
′
磷酸吡哆醛(PLP)的酶，其可以在甘氨酸的次级合成途径中催化L
‑
苏氨酸和L
‑
别
‑
苏氨酸生成甘氨酸和乙醛。苏氨酸醛缩酶的逆反应过程中涉及不对称碳
‑
碳键的形成，在体外，其可以催化α
‑
氨基酸和不同类型的醛生成β
‑
羟基
‑
α
‑
氨基酸，产生两个新的相邻立体中心。β
‑
羟基
‑
α
‑
氨基酸是许多复杂天然产物和药物的重
要组成部分，这使得该酶在医药和精细化工等领域具有巨大的应用潜力。根据其对苏氨酸α
‑
碳的立体特异性，可分为L
‑‑
苏氨酸醛缩酶(L
‑
TA)和D
‑
苏氨酸醛缩酶(D
‑
TA)。L
‑
苏氨酸醛缩酶在α
‑
碳上表现出很高的立体特异性，因此严格来说只生成L
‑
型产物，其可以催化L
‑
苏氨酸和非天然的L
‑
β
‑
羟基
‑
α氨基酸的可逆裂解生成甘氨酸和相应的醛类。L
‑
TA又可分为三类：(1)特异性裂解L
‑
别
‑
苏氨酸的L
‑
alloTA(EC4.1.2.49)；(2)特异性裂解L
‑
苏氨酸的L
‑
TA(EC4.1.2.5)；(3)对L
‑
苏氨酸和L
‑
别
‑
苏氨酸均具有裂解活性的低特异性L
‑
TA(EC4.1.2.48)。
[0006]目前为止，研究较多的生产L
‑
丝氨酸的酶是丝氨酸羟甲基转移酶，其反应过程复杂，且大部分是应用于发酵法来生产L
‑
丝氨酸。此外，其他报道的生产L
‑
丝氨酸的酶级联反应涉及到多个酶，此过程较为复杂，且产量较低。因此，仍需挖掘一个能够相对简单高效催化L
‑
丝氨酸合成的酶。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是提供一种L
‑
苏氨酸醛缩酶突变体以及在L
‑
丝氨酸合成中的应用，从而解决现有L
‑
丝氨酸的产量尚不能完全满足市场需求，且其现在主要生产方法为前体发酵法，其存在后续分离困难，纯化成本较高，对生产设备也有较高要求的问题。
[0008]为了解决上述问题，本专利技术采用以下技术方案：
[0009]根据本专利技术的第一方面，提供一种L
‑
苏氨酸醛缩酶突变体，所述L
‑
苏氨酸醛缩酶突变体包括：以SEQ ID No.2所示野生型的L
‑
苏氨酸醛缩酶为模板，第202位苏氨酸替换为丝氨酸所形成的L
‑
苏氨酸醛缩酶突变体T202S，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；以及以SEQ ID No.2所示野生型的L
‑
苏氨酸醛缩酶为模板，第202位苏氨酸替换为甘氨酸所形成的L
‑
苏氨酸醛缩酶突变体T202G，其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
[0010]所述野生型的L
‑
苏氨酸醛缩酶是一种来自于Agrobacterium菌株的L
‑
苏氨酸醛缩酶，其NCBI登录号为WP_0本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种L
‑
苏氨酸醛缩酶突变体，其特征在于，所述L
‑
苏氨酸醛缩酶突变体包括：以SEQ ID No.2所示野生型的L
‑
苏氨酸醛缩酶为模板，第202位苏氨酸替换为丝氨酸所形成的L
‑
苏氨酸醛缩酶突变体T202S，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；以及以SEQ ID No.2所示野生型的L
‑
苏氨酸醛缩酶为模板，第202位苏氨酸替换为甘氨酸所形成的L
‑
苏氨酸醛缩酶突变体T202G，其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。2.一种编码如权利要求1所述的L
‑
苏氨酸醛缩酶突变体的编码基因。3.一种包含如权利要求2所述的L
‑
苏氨酸醛缩酶突变体的编码基因的重组表达载体。4.一种包含如权利要求2所述的L
‑
苏氨酸醛缩酶突变体的编码基因的重组表达转化体。5.一种L
‑
苏氨酸醛缩酶突变体催化剂，其特征在于，所述L
‑
苏氨酸醛缩酶突变体催化剂是以下形式中的任意一种：1)培养如权利要求4所述的重组表达转化体，分离含有所述L
‑
苏氨酸醛缩酶突变体的转化体细胞；2)培养如权利要求4所述的重组表达转化体，分离含有所述L
‑
苏氨酸醛缩酶突变体的粗酶液；3)培养如权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：王华磊，郭蒙，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：