一种PRM检测促黄体生成素的试剂盒及检测方法和应用技术

本发明专利技术属于定量分析检测技术领域，具体涉及一种PRM检测促黄体生成素的试剂盒及检测方法和应用；所述试剂盒包括以下组分：促黄体生成素的重同位素标记肽段、质谱检测用试剂和纳升级高效液相色谱检测用试剂。本发明专利技术通过促黄体生成素的重同位素标记肽段对促黄体生成素进行绝对定量分析，以帮助绵羊发情阶段的判定，具有方便快捷，高选择性，高特异性及准确度高的优点，蛋白检测可达pg/mg水平。同时，本发明专利技术的试剂盒还能避免放射性免疫分析试剂的使用。用。

【技术实现步骤摘要】
一种PRM检测促黄体生成素的试剂盒及检测方法和应用


[0001]本专利技术属于定量分析检测
，具体涉及一种PRM检测促黄体生成素的试剂盒及检测方法和应用。

技术介绍

[0002]促黄体生成素(Luteotropic hormone，LH)是由腺垂体细胞分泌的一种糖蛋白类促性腺激素，可促进胆固醇在性腺细胞内转化为性激素。在绵羊排卵前会产生LH高峰，在LH峰后6～12h排卵。越靠近排卵时间完成配种就可以提高妊娠效果。因而实时定量检测绵羊的LH含量，能够实时监控绵羊排卵时间，进而确定最佳配种时期。
[0003]目前检测LH的方法主要有放射免疫分析法和酶联免疫分析法，其中放射免疫分析法有污染，分析试剂有效期短，操作繁琐；而酶联免疫分析法采用化学发光和荧光体系灵敏度低，测值不够准确，检测范围窄，保质期短。并且，放射免疫分析法和酶联免疫分析法都需要制备绵羊的单克隆抗体，绵羊的单克隆抗体制备难度较大不易获得，限制了LH检测的推广和应用。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种PRM检测促黄体生成素的试剂盒及检测方法，本专利技术的方法摆脱了绵羊的单克隆抗体的限制，并且具有高灵敏度、高特异性的优点。
[0005]本专利技术提供了一种PRM检测促黄体生成素的试剂盒，包括以下组分：促黄体生成素的重同位素标记肽段、质谱检测用试剂和纳升级高效液相色谱检测用试剂。
[0006]优选的，所述促黄体生成素的重同位素标记肽段包括重同位素标记的第一多肽和第二多肽；所述第一多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述第二多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0007]优选的，所述重同位素标记位于肽段序列C
‑
最末端的氨基酸上。
[0008]优选的，所述促黄体生成素的重同位素标记肽段的肽段序列C
‑
最末端的氨基酸上的C12和N14分别用C13和N15替代。
[0009]优选的，每条所述促黄体生成素的重同位素标记肽段的浓度为200～1000fmol/ml。
[0010]优选的，还包括色谱分析柱；所述色谱分析柱包括柱管、填料和枪头；所述填料填充于柱管内；所述枪头套在柱管的一端；所述的柱管长度为245～255mm、外径为355～365μm、内径为70～80μm；所述的填料包括C18反相填料；所述C18反向相填料的粒径为1.5～2.5μm。
[0011]本专利技术提供了一种基于上述方案所述的试剂盒的PRM检测促黄体生成素的方法，包括以下步骤：
[0012]1)对待测溶液进行酶解，得到含促黄体生成素的肽段，作为目标肽段；将所述目标肽段和促黄体生成素的重同位素标记肽段混合，得到混合肽段；
[0013]2)对所述混合肽段进行纳升级高效液相色谱分离，得到高效液相色谱分离后的肽段；
[0014]3)对所述高效液相色谱分离后的肽段进行PRM检测，得到质谱数据；
[0015]4)对所述质谱数据进行定量分析，得到促黄体生成素的定量结果。
[0016]优选的，步骤2)中所述纳升级高效液相色谱分离的条件包括：
[0017]进样量：2μL；
[0018]流动相：流动相A和流动相B；所述流动相A为体积浓度为0.1％的甲酸水溶液；所述流动相B为甲酸
‑
乙腈水溶液，所述甲酸
‑
乙腈水溶液中甲酸的体积浓度为0.1％，所述甲酸
‑
乙腈水溶液中乙腈的体积浓度为84％；所述流动相的流速为300nL/min；
[0019]洗脱方式：梯度洗脱；
[0020]所述梯度洗脱的程序为：
[0021]0～2min，所述流动相A的体积百分含量由95％匀速降低到90％，所述流动相B的体积百分含量为由5％匀速升高到10％；
[0022]2～45min，所述流动相A的体积百分含量由90％匀速降低到70％，所述流动相B的体积百分含量为由10％匀速升高到30％；
[0023]45～55min，所述流动相A的体积百分含量由70％匀速降低到0，所述流动相B的体积百分含量为由30％匀速升高到100％；
[0024]55～60min，所述流动相B的体积百分含量维持100％。
[0025]优选的，所述PRM检测的条件包括：
[0026]分析时长：60min；
[0027]检测模式：正离子；
[0028]一级质谱扫描范围：300～1800m/z；
[0029]质谱分辨率：60,000(@m/z 200)；
[0030]AGC强度：3e6；
[0031]最大离子富集时间：200ms；
[0032]每次一级MS扫描后根据靶向肽段信息列表采集20个PRM扫描；PRM扫描参数为：分离窗口：1.6Th；质谱分辨率：30,000(@m/z 200)；AGC强度：3e6；最大离子富集时间：120ms；二级碎裂模式：HCD；正态化的碰撞能量：27。
[0033]本专利技术还提供了上述方案所述试剂盒在辅助判断绵羊发情阶段中的应用。
[0034]本专利技术提供了一种PRM检测促黄体生成素的试剂盒，包括以下组分：促黄体生成素的重同位素标记肽段、质谱检测用试剂和纳升级高效液相色谱检测用试剂。本专利技术利用促黄体生成素的重同位素标记肽段作为标准品即标准肽段，通过PRM质谱获得离子峰面积，再通过定量分析获得促黄体生成素的定量结果，以帮助绵羊发情阶段的判定，具有方便快捷，高选择性，高特异性及准确度高的优点，蛋白检测可达pg/mg水平。同时，本专利技术的试剂盒还能避免放射性免疫分析试剂的使用。
具体实施方式
[0035]本专利技术提供了一种PRM检测促黄体生成素的试剂盒，包括以下组分：促黄体生成素的重同位素标记肽段、质谱检测用试剂和纳升级高效液相色谱检测用试剂。
[0036]在本专利技术中，所述促黄体生成素的重同位素标记肽段包括重同位素标记的第一多肽和第二多肽；所述第一多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：LSSTDCGGPR；所述第二多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：VCTYHELR；所述重同位素标记位于肽段序列C
‑
最末端的氨基酸上；所述促黄体生成素的重同位素标记肽段的肽段序列C
‑
最末端的氨基酸上的C12和N14分别用C13和N15替代；每条所述促黄体生成素的重同位素标记肽段的浓度(C
S
)优选为200～1000fmol/ml，更优选为500～800fmol/ml；所述促黄体生成素的重同位素标记肽段溶解于溶解缓冲液中；所述溶解缓冲液包括甲酸(FA)水溶液；所述甲酸水溶液中甲酸的体积浓度为0.1％。在本专利技术中，所述促黄体生成素的重同位素标记肽段优选的盛装于试管中；所述促黄体生成素的重同位素标记肽段和溶解缓冲液混合后，进行离心，收集上清液；本专利技术对所述混合的方式没有特殊限制，以混合均匀为准；所述离心的转速优选为12000～1300本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种PRM检测促黄体生成素的试剂盒，包括以下组分：促黄体生成素的重同位素标记肽段、质谱检测用试剂和纳升级高效液相色谱检测用试剂。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述促黄体生成素的重同位素标记标准肽段包括重同位素标记的第一多肽和第二多肽；所述第一多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述第二多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述重同位素标记位于肽段序列C
‑
最末端的氨基酸上。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述促黄体生成素的重同位素标记肽段的肽段序列C
‑
最末端的氨基酸上的C12和N14分别用C13和N15替代。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，每条促黄体生成素的所述重同位素标记肽段的浓度为200～1000fmol/ml。6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括色谱分析柱；所述色谱分析柱包括柱管、填料和枪头；所述填料填充于柱管内；所述枪头套在柱管的一端；所述的柱管长度为245～255mm、外径为355～365μm、内径为70～80μm；所述的填料包括C18反相填料；所述C18反向相填料的粒径为1.5～2.5μm。7.一种基于权利要求1～6任意一项所述的试剂盒的PRM检测促黄体生成素的方法，包括以下步骤：1)对待测溶液进行酶解，得到含促黄体生成素的肽段，作为目标肽段；将所述目标肽段和促黄体生成素的重同位素标记肽段混合，得到混合肽段；2)对所述混合肽段进行纳升级高效液相色谱分离，得到高效液相色谱分离后的肽段；3)对所述高效液相色谱分离后的肽段进行PRM检测，得到质谱数据；4)对所述质谱数据进行定量分析，得到促黄...

【专利技术属性】
技术研发人员：王翔宇，储明星，狄冉，贺小云，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：