一种双熵驱动放大体系结合银纳米簇用于多重靶标microRNA检测的分析方法技术

本发明专利技术公开了一种熵驱动放大体系结合银纳米簇用于多重靶标microRNA检测的分析方法，我们将靶标循环放大与信号产生设计在同一个体系中，基于富含鸟嘌呤(G

【技术实现步骤摘要】
一种双熵驱动放大体系结合银纳米簇用于多重靶标microRNA检测的分析方法


[0001]本专利技术属于生物化学分析方法，具体涉及一种用于检测多重靶标microRNA的双熵驱动放大体系及其应用方法。

技术介绍

[0002]细胞内microRNAs(miRNA)水平的差异为癌症的早期诊断和治疗提供了很多有价值的信息。有研究表明，癌症的发生与多个miRNAs共同相关，检测单个miRNA有可能无法达到精确诊断的要求，因此开发可用于多种miRNAs同时检测的传感平台尤为重要。为了提高靶标检测的灵敏度，研究者们已经开发了多种核酸扩增平台，主要包括有酶介导和无酶介导两大类，其中常见的酶介导的核酸扩增技术有聚合酶链式反应(PCR)、滚环扩增反应(RCA)，双链特异性核酸酶(DSN)介导的靶标循环信号放大等，虽然这些核酸扩增技术具有较高的灵敏度，但因为有酶的存在，对环境要求(如温度、pH等)比较苛刻，限制了很多方面的应用。无酶介导的核酸扩增技术主要依赖于DNA链段的杂交和链置换反应，进而实现靶标循环的信号放大。熵驱动放大反应，是通过粘性末端介导的分支迁移和链置换反应，实现靶标的循环从而放大信号。其作为无酶介导的核酸扩增技术的一种，与其它无酶扩增技术相比，操作更简便、快速，具有更好的选择性，尤其适用于多种靶标的分析。以DNA为模板的银纳米簇(DNA
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AgNCs)具有独特的发光特性，良好的生物相容性和荧光稳定性，更重要的是其荧光发射波长和颜色都可以根据设计不同的DNA模板来调节，使其广泛应用于生物传感和细胞成像领域中。因此，基于双熵驱动反应信号放大，结合变色AgNCs荧光信号方法，为多种miRNA的同时检测提供了一种独特的新思路。

技术实现思路

[0003]有鉴于此，我们将双熵驱动放大设计整合在同一个DNA组装结构内，同时利用两种发射波长的AgNCs模板序列分别作为两个熵驱动体系的燃料链，共同结合在该体系中，并利用G
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rich序列邻近诱导的AgNCs荧光增强和AgNCs二聚体形成导致的荧光信号打开，构建了一种简单、无酶、快速的传感平台用于多种靶标的同时检测分析。
[0004]本专利技术具体提供了如下的技术方案：
[0005]1、一种简单、无酶、快速的传感平台用于多种靶标的同时检测分析。首先将F
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41
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DNA 或L21
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DNA或F21
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DNA在PB缓冲液中以DNA:AgNO3:NaBH4＝1:6:6。独立检测时，将 L141、S141、Linker或L21
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AgNCs、S21、Linker链按1:1:1的摩尔比在PB和CH3COONa 缓冲液中混合退火形成稳定的三链DNA底物。检测时靶标1miRNA
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141，在预先形成好的(L141、S141、Linker)三链DNA底物中先加入F141
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AgNCs，再加入不同浓度的 miRNA
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141，充分混合均匀，25℃下反应2h，检测585nm处荧光强度。检测时靶标2 miRNA
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21，在预先形成好的(L21
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AgNCs、S21、Linker)三链DNA底物中先加入F21
‑ꢀ
AgNCs，再加入不同浓度的miRNA
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21，充分混合均匀，25℃下反应2h，检测630nm处荧光强度。
S141、Linker、L21
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AgNCs、S21)的浓度为200nM，F141
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AgNCs的浓度为300nM， F21
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AgNCs的浓度为400nM，终反应时间为120min。
[0023]本专利技术的有益效果在于：在该分析方法中，我们基于G
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rich邻近诱导的AgNCs荧光增强和两个不发光的AgNCs单体紧密靠近形成荧光增强的AgNCs二聚体这两种不同发射波长的AgNCs荧光“关
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开”设计，将其引入到一个共同的双熵驱动靶标循环信号放大体系中，成功实现了两种不同靶标共存时的两种颜色荧光信号的同时响应增强。随着靶标1miRNA
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141浓度的增加，G
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rich增强的585nm处橙色荧光逐渐增强，在较低浓度下存在线性关系；随着靶标2miRNA
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21浓度的增加，630nm处的二聚体红色荧光也逐渐增强，通过对两种荧光信号增强分别或同时对这两种靶标进行检测分析，该分析方法将多色的荧光AgNCs与熵驱动信号放大体系结合，在一次检测中可筛选出多种分析物，能对多种miRNA实现快速、超灵敏同时检测。
附图说明
[0024]为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图：
[0025]图1为本专利技术的双熵驱动放大体系结合银纳米簇用于多重靶标的分析方法的示意图；
[0026]图2为F141
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AgNCs和L141+F141
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AgNCs的UV
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vis光谱图；
[0027]图3为F141
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AgNCs和L141+F141
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AgNCs的荧光光谱图；L21
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AgNCs、F21
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AgNCs 和L21
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AgNCs+F21
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AgNCs二聚体的荧光光谱图；
[0028]图4为验证同时检测miRNA
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141和miRNA
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21的凝胶电泳图；
[0029]图5为三链DNA底物与F链不同比例下的归一化荧光结果；
[0030]图6为熵驱动放大体系反应时间的确定；
[0031]图7中(A)为单检测体系荧光强度随miRNA
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141浓度变化的光谱图；(B C)体系荧光强度随miRNA
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141浓度变化的关系图；
[0032]图8中(A)为单检测体系荧光强度随miRNA
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21浓度变化的光谱图；(B C)体系荧光强度随miRNA
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21浓度变化的关系图；
[0033]图9中(A)为双检测体系荧光强度随miRNA
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141、miRNA
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21浓度变化的光谱图； (B C D E)体系荧光强度随miRNA
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141、miRNA
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21浓度变化的关系图；
[0034]图10中(A)为检测miRNA
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141的特异性；(B)检测miRNA
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21的特异性；
[0035]图11中(A)为在Buffer和1％Serum中检测miRNA
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141；(B)在Buffer和1％Serum 中检测miRNA
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21...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种双熵驱动放大体系结合银纳米簇用于多重靶标检测的分析方法，其特征在于，步骤为：1)用PB缓冲液将一定体积一定浓度的F141或L21或F21与AgNO3溶液混合，剧烈振荡5s，置于4℃的冰水浴中避光孵育1h；2)将步骤1)中孵育后的溶液中加入NaBH4溶液，剧烈振荡20s，置于4℃的冰水浴里避光孵育过夜，制备F141
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AgNCs/L21
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AgNCs/F21 AgNCs单体；3)将L141、S141、Linker或L21
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AgNCs、S21、Linker等体积等浓度混合，在PB和CH3COONa缓冲液中退火至25℃，反应2h形成三链杂交DNA底物；4)将L141、S141、Linker、L21
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AgNCs、S21等体积等浓度混合，在PB和CH3COONa缓冲液中退火至25℃，反应2h形成五链杂交DNA底物；5)单独检测加燃料链：在步骤3)得到的三链DNA底物中加入燃料链F141
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AgNCs或F21
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AgNCs，充分混合均匀；稀释后分到10个PCR管中；6)同时检测加燃料链：在步骤4)得到的五链DNA底物中加入加燃料链F141
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AgNC和F21
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AgNCs，充分混合均匀；稀释后分到10个PCR管中；7)单独检测：向步骤5)的每个PCR管中加入不同浓度的miRNA
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141或miRNA
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21，对照组加入buffer，25℃下反应30min，进行荧光测试，得到miRNA
‑
141或miRNA
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21的特异性检测结果；8)同时检测：向步骤6)的每个PCR管中加入不同浓度的miRNA
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141和miRNA
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21，对照组加入buffer，25℃下反应30min，进行荧光测试，得到miRNA
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141和miRNA
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21的特异性检测结果。2.根据权利要求1所述的一种双熵驱动放大体系结合银纳米簇用于多重靶标检测的分析方法，其特征在于，步骤1)所述DNA(F141或L21或F21):AgNO3摩尔比保持在1:6；步骤2)所述DNA(F141或L21或F21)、AgNO3和NaBH4的摩尔比始终保持在1:6:6；步骤3)所述L141、S141、Linker或L21
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AgNCs、S21、Linker链摩尔比始终保持在1:1:1；步骤4)所述L141、S141、Linker、L21
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AgNCs、S21链摩尔比始终保持在1:1:1:1:1。3.根据权利要求1所述的一种双熵驱动放大体系结合银纳米簇用于多重靶标检测的分析方法，其特征在于，步骤1)所述PB缓冲液含20mM Na2HPO4和NaH2PO4，pH＝7.4；步骤1)所述的AgNO3溶液浓度为1.8μM；步骤2)所述的NaBH4溶液浓度为1.8μM。4.根据权利要求1所述的一种双熵驱动放大体系结合银纳米簇用于多重靶标检测的分析方法，其特征在于，步骤3)和步骤4)所述的退火过程在95℃下加热5min，以
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5℃/min的速率降至65℃，再以
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1℃/min速率降至25℃。5.根据权利要求1所述的一种双熵驱动放大体系结合银纳米簇用于多重靶标的分析，其特征在于，所述检测靶标1即miRNA

【专利技术属性】
技术研发人员：张瑛洧，王洪，刘子瑞，张晓伟，韩鑫，杨宏群，崔方丽，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：