PHA转录调控蛋白PhaQ作为表面活性剂的制备与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种PHA转录调控蛋白PhaQ作为表面活性剂的制备与应用，制备过程包括质粒构建、蛋白表达与纯化的步骤；并将制备的PHA转录调控蛋白PhaQ作为生物表面活性剂来应用。本发明专利技术的制备方法简单、设备成本低，且制备的PHA调控蛋白PhaQ对柴油、润滑油、植物油均有较好的乳化能力，且能形成相当稳定的乳化结构。且能形成相当稳定的乳化结构。且能形成相当稳定的乳化结构。

【技术实现步骤摘要】
PHA转录调控蛋白PhaQ作为表面活性剂的制备与应用


[0001]本专利技术涉及微生物
，更具体涉及一种PHA转录调控蛋白PhaQ作为表面活性剂的制备与应用。

技术介绍

[0002]生物表面活性剂是指微生物来源的表面活性剂，而非用化学合成方法制得的产品，其一般为某种功能微生物的代谢产物，经提纯而得。生物表面活性剂是一种可降解的表面活性剂，不仅具有增溶、乳化、润湿、发泡、分散、降低表面张力等表面活性剂所共有的性能，与其他通过化学合成或石油炼制法生产的表面活性剂相比，还具有无毒、可生物降解、生态安全以及高表面活性等优点。生物表面活性剂可应用于石油、环保、医药、食品、化妆品、日用化工、家居护理、农业、饲料、水果保鲜等领域，可达到部分或完全替代化学合成表面活性剂使用。据已知的数据表明，槐糖脂和鼠李糖脂主要应用方向还是油田开采领域，化妆、洗护等高附加值的领域，还有部分应用于粮食增产或饲料等行业。其他类生物表面活性剂多数还只是存在于实验室和论文中，没有大面积的应用。
[0003]聚羟基脂肪酸酯(PHA)是微生物体内作为能量储存物质的一种线性聚酯。PHA是微生物在生长条件失衡的情况下应对外界胁迫的产物，尤其当氮、磷等生长必需营养物缺乏而碳源过量的情况下，细菌体内更容易积累PHA；当环境中碳源匮乏而其他营养元素充足时，PHA可以被细菌降解，参与菌体能量代谢从而为菌体生长供能。PHA合成菌聚积的PHA绝大多数以颗粒状内含物的形式出现。天然PHA微球内部是由多条线性聚酯链缠绕而成的疏水核心，外层由单分子磷脂包覆，磷脂层上嵌入或吸附有PHA聚合酶、PHA膜结合蛋白等PHA表面结合蛋白。这些PHA表面结合蛋白均具有亲水区与疏水区，这种特性决定了PHA表面结合蛋白作为生物表面活性剂的巨大开发潜力。
[0004]芽孢杆菌在不平衡的生长条件下也可以积累PHA，并且芽孢杆菌能够利用多种廉价碳源进行发酵生产PHA。之前筛到过一株可以高产PHA的蜡样芽孢杆菌HBL
‑
AI，其PHA合成相关蛋白包括：(R)
‑
烯酰辅酶A水合酶(PhaJ)；PHA膜结合蛋白(PhaP)，转录调控蛋白(PhaQ)；调控蛋白(PhaR)；编码NADPH依赖型乙酰乙酰辅酶A还原酶(PhaB)；PHA聚合酶(PhaC)。而菌株PHA表面结合蛋白的生物活性还未进行开发。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供一种PHA转录调控蛋白PhaQ作为表面活性剂的制备与应用，以解决菌株PHA表面结合蛋白的生物活性还未进行开发的问题，以提供一种简单的制备PHA调控蛋白PhaQ的方法，并证明其作为表面活性剂来应用的可行性。
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术所采取的技术方案如下。
[0007]PHA转录调控蛋白PhaQ作为表面活性剂的制备，包括具体包括以下步骤：
[0008]A、质粒构建：以HBL
‑
AI全基因组为模板设计引物，使用引物对目的基因片段进行扩增；使目的基因片段经酶切、连接、转化后挑取阳性转化子并测序验证，选择成功构建的
重组质粒pET
‑
28a(+)&phaQ；
[0009]B、蛋白表达及纯化：将重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)plysS中，选取单菌落进行培养，取适量种子液进行再次培养，然后离心取上清液检测蛋白表达量；将剩余菌液洗涤后超声破碎，取上清液和沉淀检测蛋白是否为可溶性表达；
[0010]C、预处理层析柱，将菌液离心后过经过固定化金属亲和层析、脱盐、浓缩后得到了纯化后的PhaQ蛋白，使用BCA法准确测定蛋白溶液的浓度。
[0011]进一步优化技术方案，所述步骤A中扩增后的PCR产物经电泳分离后切下目的条带并纯化，测定纯化后的浓度，然后置于
‑
20℃环境下保存；然后使用限制性内切核酸酶在37℃消化1h，然后再次进行电泳分离并对目的条带进行纯化，测定纯化后的浓度，然后置于
‑
20℃环境下保存。
[0012]进一步优化技术方案，所述电泳分离为经琼脂糖凝胶电泳分离；所述纯化指使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化。
[0013]进一步优化技术方案，步骤A中所述的连接过程为插入片段/载体，片段/载体的摩尔比为6：1，放入DNA Ligation Kit中连接一夜。
[0014]进一步优化技术方案，所述转化过程为将连接过程的产物转化E.coli DH5α感受态细胞；所述测序验证的菌株为疑似的阳性的菌株，测序验证的过程为将疑似的阳性的菌株冻存后提取质粒，使用BamHI&XhoI对质粒进行双酶切后琼脂糖凝胶电泳验证片段大小，片段大小正确的标记为阳性克隆，复苏菌种后送测序，选择目的片段完全正确的菌株。
[0015]进一步优化技术方案，所述步骤B中单菌落培养的条件为，卡那霉素LB培养基、37℃、200rpm振荡培养过夜；所述再次培养为含卡那霉素100μg/mL的pET
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Lac自诱导培养基，37℃、200rpm振荡培养20h；所述上清液检测蛋白表达量的方法为，取500μL菌液8000rpm离心5min，去上清，加50μLPBS重悬菌体，加10μL 6
×
Protein Loading Buffer，100℃加热20min，6000rpm离心5min，取上清做SDS
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聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS
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PAGE)检测蛋白表达量。
[0016]进一步优化技术方案，所述步骤C中层析过程采用组装层析柱，以梯度洗脱的方法洗脱目的蛋白，并分别收集每个咪唑浓度的蛋白洗脱液，以检测蛋白含量及纯度。
[0017]本专利技术还提供了PHA转录调控蛋白PhaQ作为表面活性剂的应用，所述应用方式为将PhaQ蛋白溶液用于对油的乳化。
[0018]进一步优化技术方案，所述油包括柴油、润滑油、植物油。
[0019]由于采用了以上技术方案，本专利技术所取得技术进步如下。
[0020]本专利技术提供的PHA转录调控蛋白PhaQ作为表面活性剂的制备与应用，制备过程包括质粒构建、蛋白表达与纯化的过程，制备过程所用的设备简单、生产环境简单安全、制备成本低；本专利技术将PHA转录调控蛋白PhaQ作为生物表面活性剂，制成的表面活性剂具有对柴油、润滑油、植物油均有较好的乳化能力，且能形成相当稳定的乳化结构。
附图说明
[0021]图1为本专利技术中重组质粒的质粒图谱；
[0022]图2为本专利技术中PhaQ蛋白纯化后SDS
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PAGE图；
[0023]图3为本专利技术中PhaQ蛋白质、SDS、Tween
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20、油酸钠、BSA分别对柴油的乳化效果图；
[0024]图4为本专利技术中PhaQ蛋白质、SDS、Tween
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20、油酸钠、BSA分别与柴油的乳化值图；
[0025]图5为本专利技术中PhaQ蛋白质、SDS、Tween...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.PHA转录调控蛋白PhaQ作为表面活性剂的制备，其特征在于，具体包括以下步骤：A、质粒构建：以生产PHA的蜡样芽孢杆菌HBL
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AI全基因组为模板设计引物，使用引物对目的基因片段进行扩增；使目的基因片段经酶切、连接、转化后，挑取阳性转化子并测序验证，选择成功构建的重组质粒pET
‑
28a(+)&phaQ；B、蛋白表达：将重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)plysS中，选取单菌落进行培养，取适量种子液进行再次培养，然后离心取上清液检测蛋白表达量；将剩余菌液洗涤后超声破碎，取上清液和沉淀检测蛋白是否为可溶性表达；C、目的蛋白纯化：预处理层析柱，将菌液离心后过经过固定化金属亲和层析、脱盐、浓缩后得到了纯化后的PhaQ蛋白，使用BCA法准确测定蛋白溶液的浓度。2.根据权利要求1所述的PHA转录调控蛋白PhaQ作为表面活性剂的制备，其特征在于：所述步骤A中扩增后的PCR产物经电泳分离后切下目的条带并纯化，测定纯化后的浓度，然后置于
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20℃环境下保存；然后使用限制性内切核酸酶在37℃消化1h，然后再次进行电泳分离并对目的条带进行纯化，测定纯化后的浓度，然后置于
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20℃环境下保存。3.根据权利要求2所述的PHA转录调控蛋白PhaQ作为表面活性剂的制备，其特征在于：所述电泳分离为经琼脂糖凝胶电泳分离；所述纯化指使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化。4.根据权利要求1所述的PHA转录调控蛋白PhaQ作为表面活性剂的制备，其特征在于：步骤A中所述的连接过程为插入片段/载体，片段/载体的摩尔比为6：1，放入DNA Ligation Kit中连接一夜。5.根据权利要求4所述的PHA转录调控蛋白PhaQ作为...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏胜杰，张路路，张红蕾，刘刚，傅双庆，
申请(专利权)人：河北牧群生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：