一种抗氧化节杆菌及其次级代谢产物的制备和应用制造技术

本发明专利技术涉及一种抗氧化节杆菌，该节杆菌来源于珠穆朗玛峰北坡东绒布冰川土壤，其分类命名为抗氧化节杆菌（Arthrobacter sp.QL17），在广东省微生物菌种保藏中心的保藏编号为GDMCC 1.2948。同时，本发明专利技术还公开了该抗氧化节杆菌的次级代谢产物及其制备和应用。本发明专利技术首次公开了抗氧化节杆菌的次级代谢产物arthroxanthin的制备方法及该类胡萝卜素的清除DPPH自由基能力，对后续arthroxanthin的工业开发都具有重大意义。重大意义。重大意义。

【技术实现步骤摘要】
一种抗氧化节杆菌及其次级代谢产物的制备和应用


[0001]本专利技术涉及天然产物分离提纯领域，尤其涉及一种抗氧化节杆菌及其次级代谢产物（arthroxanthin）的制备和应用。

技术介绍

[0002]几乎所有的人工合成色素都不能向人类提供营养物质，某些合成色素甚至会危害人体健康，引起中毒和癌变等人类健康问题。因此，近年来市场上关于天然、无毒、生态友好型色素的需求量逐渐增大。根据市场调研显示，在各种色素中仅类胡萝卜素一项，到2022年市场份额将达到20亿美元。临床和流行病学研究证明，水果和蔬菜的膳食摄入量越少的人，慢性疾病（如Ⅱ型糖尿病、心血管疾病和癌症）的发病率越高。这是由于水果和蔬菜中的生物活性抗氧化化合物，包括类胡萝卜素，能够中和生物体内自由基，从而最大限度地减少氧化损伤和相关疾病的发生率。
[0003]类胡萝卜素(carotenoids)是广泛分布于植物和微生物中的一类色素。迄今为止，已从天然来源中鉴定出1204个类胡萝卜素，其中大多为C40类胡萝卜素（1121），其次是C50（37）、C30（33）和C45（13）。基于类胡萝卜素数据库(http://carotenoiddb.jp)统计发现，细菌能够合成迄今发现的所有C45、大多数的C30以及C50类胡萝卜素。现有研究报道了179种细菌能够产生类胡萝卜素(数据截止：2020年11月)，主要分布于变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)、绿菌门(Chlorobi)。r/>[0004]近年来，国内外科学家先后分别从土壤中分离到能产生类胡萝卜素的细菌，并建立了较完善的液体发酵产类胡萝卜素体系，制备了类胡萝卜素粗品，通过对其生物活性进行研究，纯化得到的类胡萝卜素均具有较强的抗氧化活性。目前，类胡萝卜素发酵纯化工艺距工业化生产还有很大距离，这在很大程度上限制了其应用。因此，需要进一步研究其发酵纯化工艺，通过工艺优化，改进发酵纯化条件，创造适合菌体生长和生物代谢的最佳条件，充分发挥菌种的生产潜力，显著提高类胡萝卜素产量。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种抗氧化节杆菌。
[0006]本专利技术所要解决的另一个技术问题是提供该抗氧化节杆菌的次级代谢产物（arthroxanthin）。
[0007]本专利技术所要解决的第三个技术问题是提供该次级代谢产物（arthroxanthin）的制备和应用。
[0008]本专利技术所要解决的第四个技术问题是提供该次级代谢产物（arthroxanthin）的应用。
[0009]为解决上述问题，本专利技术所述的一种抗氧化节杆菌，其特征在于：该节杆菌来源于珠穆朗玛峰北坡东绒布冰川土壤，其分类命名为抗氧化节杆菌（Arthrobacter sp. QL17），
在广东省微生物菌种保藏中心的保藏编号为GDMCC 1.2948（保藏单位地址：中国. 广东广州市越秀区先烈中路100号广东省微生物研究所；保藏日期：2021年12月01日）。
[0010]如上所述的一种抗氧化节杆菌的次级代谢产物，其特征在于：该次级代谢产物为类胡萝卜素（arthroxanthin），其结构式如下：。
[0011]如上所述的一种抗氧化节杆菌的次级代谢产物的制备方法，包括以下步骤：
⑴
固体培养：将在
‑
80℃冰箱中保存的抗氧化节杆菌QL17涂布于R2A琼脂平板培养基上，于15℃培养箱中培养5d，得到平板菌种；
⑵
种子培养：取生长良好的平板菌种，接种于装液量为30%的R2A液体培养基中，在15℃、160rpm的条件下培养72h，得到种子液；
⑶
发酵培养：取生长良好的种子液，按体积分数5%的接种量接种于装液量为30%的R2A液体培养基中，于15℃、160rpm的条件下培养3d，得到菌体；
⑷
菌体的前处理：将菌体加到其5倍体积量的100%甲醇中进行萃取，萃取次数为2次，直至菌体变为无色；合并两次萃取所得，得到类胡萝卜素萃取液；所述类胡萝卜素萃取液经旋转蒸发至干、甲醇复溶，得到类胡萝卜素粗提物；
⑸
正向硅胶柱分离：所述类胡萝卜素粗提物采用干法拌样，在正向硅胶柱上分离纯化，采用石油醚装柱，上样后氯仿
‑
丙酮梯度混合物洗脱，得到A~D四个馏分；其中A馏分体积比为5:1的氯仿和丙酮，B馏分体积比为3:1的氯仿和丙酮，C馏分体积比为1:1的氯仿和丙酮，D为甲醇洗脱；
⑹
Sephadex LH
‑
20 分子筛分离：在体积比为1:1的CHCl3和MeOH构成的流动相中，将所述步骤
⑸
所得的馏分C在Sephadex LH
‑
20 分子筛上反复纯化和分离，共得到14个馏分，其中红色液体确定为馏分C12；
⑺
半制备型高效液相色谱分离：将所述馏分C12用半制备型高效液相色谱 (HPLC) C18 柱纯化，即得次级代谢产物类胡萝卜素纯品。
[0012]所述步骤
⑴
中R2A琼脂平板培养基是指将酵母浸出粉0.5g、蛋白胨0.5g、酪蛋白水解物0.5g、葡萄糖0.5g、可溶性淀粉0.5g、磷酸氢二钾0.3g、无水硫酸镁0.024g、丙酮酸钠0.3g、20g琼脂与1L纯水混合均匀后，即得。
[0013]所述步骤
⑵
和所述步骤
⑶
中R2A液体培养基是指将酵母浸出粉0.5g、蛋白胨0.5g、酪蛋白水解物0.5g、葡萄糖0.5g、可溶性淀粉0.5g、磷酸氢二钾0.3g、无水硫酸镁0.024g、丙酮酸钠0.3g与1L纯水混合均匀后，即得。
[0014]所述步骤
⑸
中正向硅胶柱分离的条件是指正向硅胶柱的尺寸为5 cm
ꢀ×ꢀ
60 cm，
填充高度 40 cm，硅胶粒径为100~200目。
[0015]所述步骤
⑸
中梯度洗脱的氯仿
‑
丙酮的体积比依次为5:1, 3:1, 1:1。
[0016]所述步骤
⑺
中C18 柱的尺寸为10 mm
ꢀ×ꢀ
250 mm, 填充高度 250 mm。
[0017]所述步骤
⑺
中半制备型高效液相色谱分离的条件是指流动相由体积比为9:1的MeOH和H2O构成；进样前基线稳定10min后进样，每次进样1ml；检测器波长为254nm，流动相流速为2.0 ml/min；收集含新型类胡萝卜素纯品的的出峰时间为34min。
[0018]如上所述的一种抗氧化节杆菌的次级代谢产物在抗氧化方面的应用，其特征在于：该次级代谢产物对二苯基苦基苯肼自由基（DPPH）具有抑制作用，其半抑制浓度IC
50
为69.82
ꢀµ
g/mL。
[0019]本专利技术与现有技术相比具有以下优点：1、本专利技术首本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗氧化节杆菌，其特征在于：该节杆菌来源于珠穆朗玛峰北坡东绒布冰川土壤，其分类命名为抗氧化节杆菌（Arthrobacter sp. QL17），在广东省微生物菌种保藏中心的保藏编号为GDMCC 1.2948。2.如权利要求1所述的一种抗氧化节杆菌的次级代谢产物，其特征在于：该次级代谢产物为类胡萝卜素（arthroxanthin），其结构式如下：。3.如权利要求2所述的一种抗氧化节杆菌的次级代谢产物的制备方法，包括以下步骤：
⑴
固体培养：将在
‑
80℃冰箱中保存的抗氧化节杆菌QL17涂布于R2A琼脂平板培养基上，于15℃培养箱中培养5d，得到平板菌种；
⑵
种子培养：取生长良好的平板菌种，接种于装液量为30%的R2A液体培养基中，在15℃、160rpm的条件下培养72h，得到种子液；
⑶
发酵培养：取生长良好的种子液，按体积分数5%的接种量接种于装液量为30%的R2A液体培养基中，于15℃、160rpm的条件下培养3d，得到菌体；
⑷
菌体的前处理：将菌体加到其5倍体积量的100%甲醇中进行萃取，萃取次数为2次，直至菌体变为无色；合并两次萃取所得，得到类胡萝卜素萃取液；所述类胡萝卜素萃取液经旋转蒸发至干、甲醇复溶，得到类胡萝卜素粗提物；
⑸
正向硅胶柱分离：所述类胡萝卜素粗提物采用干法拌样，在正向硅胶柱上分离纯化，采用石油醚装柱，上样后氯仿
‑
丙酮梯度混合物洗脱，得到A~D四个馏分；其中A馏分体积比为5:1的氯仿和丙酮，B馏分体积比为3:1的氯仿和丙酮，C馏分体积比为1:1的氯仿和丙酮，D为甲醇洗脱；
⑹
Sephadex LH
‑
20 分子筛分离：在体积比为1:1的CHCl3和MeOH构成的流动相中，将所述步骤
⑸
所得的馏分C在Sephadex LH
‑
20 分子筛上反复纯化和分离，共得到14个馏分，其中红色液体确定为馏分C12；
⑺
半制备型高效液相色谱分离：将所述馏分C12用半制备型高效液相色谱C18 柱纯化，即得次级代谢产物类胡萝卜素纯品。4.如权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：于雪，张威，章高森，刘光琇，陈拓，吴玉洁，
申请(专利权)人：中国科学院西北生态环境资源研究院，
类型：发明
国别省市：