一种基于MIRA技术快速鉴别肉制品中羊源性成分的方法技术

本发明专利技术提供了一种基于MIRA技术快速鉴别肉制品中羊源性成分的方法，属于食品安全生物技术领域。本发明专利技术首先提供了一种鉴别肉制品中羊源性成分的引物探针组合，它包括正向引物、反向引物和探针；所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述反向引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。本发明专利技术还提供了含该引物探针组合的试剂盒以及具体鉴别方法。本发明专利技术鉴别肉制品中羊源性成分的检测方法条件温和、操作简便、特异性强、灵敏度高、可靠性好，结果可视化，十分利于现场检测。本发明专利技术检测方法为现场快速、简捷、灵敏的检测肉制品羊源性成分提供一种新的选择，具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种基于MIRA技术快速鉴别肉制品中羊源性成分的方法


[0001]本专利技术属于食品安全生物
，具体涉及一种基于MIRA技术快速鉴别肉制品中羊源性成分的方法。

技术介绍

[0002]随着市场全球化及贸易自由化的不断发展，消费者对肉制品产品质量和真实性越来越重视，肉制品安全提升到一个新的高度。近年来，国内外肉类掺假事件时有发生，引发社会广泛关注，对食品安全和食品贸易造成严重危害。肉类掺假的方式越来越多，形式越来越复杂。目前，肉制品的掺假主要表现为原料肉掺假、组织替换等，这些肉类真实性问题不但严重地侵害了消费者利益，更是给肉制品食用安全带来潜在危害，同时也可能带来宗教信仰和道德标准方面的风险。
[0003]因此，肉制品动物源性成分检测变得越来越重要，核酸检测可以从样品中检测出痕量目标分子，具有灵敏特异等诸多优势，已成为食品真实性研究中必要的技术手段，并在检测领域中得到广泛应用。但是，传统的核酸检测技术对实验室环境、仪器及人员要求较高，无法满足现场检测监管需求。
[0004]一些新型检测方法，如重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)、多酶恒温快速扩增技术(Multienzyme Isothermal Rapid Amplification，MIRA)等，由于不需要高温变性、退火等步骤，对精密仪器依赖程度大大降低，是实现现场即时检测的有效技术手段。同时结合侧向流层析技术(Lateral Flow Dipstick，LFD)，不仅可以达到简捷、灵敏、特异的检测目的，而且能更好地为现场动物源成分检测提供可视化应用服务。但是这些方法的关键在于寻找到合适的引物，引物的选择会影响检测速度和灵敏度。目前，寻找到合适的引物是肉制品动物源性成分检测的难点。
[0005]寻找到一种合适的引物，提供一种新的肉制品中羊源性成分检测方法，为现场快速、简捷、灵敏的检测肉制品中羊源性成分提供一种新的选择，对于食品安全具有重要意义。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种基于MIRA技术快速鉴别肉制品中羊源性成分的方法。
[0007]本专利技术提供了一种鉴别肉制品中羊源性成分的引物探针组合，它包括正向引物、反向引物和探针；所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
[0008]本专利技术还提供了前述的引物探针组合在鉴别肉制品中羊源性成分的用途。
[0009]进一步地，所述用途为在制备鉴别肉制品中羊源性成分的试剂盒中的用途。
[0010]进一步地，所述鉴别肉制品中羊源性成分的方法为多酶恒温快速扩增可视化技术。
[0011]进一步地，所述多酶恒温快速扩增可视化技术为多酶恒温快速扩增技术结合侧向
流层析技术。
[0012]本专利技术还提供了一种鉴别肉制品中羊源性成分的试剂盒，所述试剂盒包括前述的引物探针组合。
[0013]进一步地，所述鉴别肉制品中羊源性成分的方法为多酶恒温快速扩增可视化技术。
[0014]进一步地，所述多酶恒温快速扩增可视化技术为多酶恒温快速扩增技术结合侧向流层析技术。
[0015]本专利技术还提供了一种鉴别肉制品中羊源性成分的方法，它包括如下步骤：
[0016](1)提取待测样品的DNA作为模板；
[0017](2)将前述的引物探针组合加入到含DNA模板的扩增体系中；
[0018](3)使用多酶恒温快速扩增可视化技术进行检测；
[0019](4)读取结果。
[0020]进一步地，步骤(2)中，所述扩增体系中正向引物、反向引物、探针和DNA模板的体积比为0.1～0.5：0.1～0.5：0.01～0.2：1；所述正向引物和反向引物的体积比为1：1；
[0021]和/或，步骤(2)中，所述扩增体系的反应温度为30～40℃；和/或，所述扩增时间为1～10min；
[0022]优选地，步骤(2)中，所述扩增体系中正向引物、反向引物、探针和DNA模板的体积比为0.25～0.5：0.25～0.5：0.075～0.15：1；所述正向引物和反向引物的体积比为1：1；
[0023]和/或，步骤(2)中，所述扩增体系的反应温度为37℃；和/或，所述扩增时间为5min；
[0024]和/或，步骤(2)中，所述扩增体系中引物的浓度为10μmol/L；和/或，所述扩增体系中探针的浓度为10μmol/L。
[0025]本专利技术成功筛选出肉制品中羊源性成分的多酶恒温快速扩增可视化技术检测体系的最优引物探针组合，提供了一种检测肉制品中羊源性成分的MIRA
‑
LFD检测体系。本专利技术MIRA
‑
LFD检测体系将MIRA技术和LFD技术相结合，不仅检测条件温和、操作简便、特异性强、灵敏度高、可靠性好，并且结果可视化，十分利于现场检测。本专利技术检测方法同时具有良好的可靠性、时效性、操作性和安全性，为现场快速、简捷、灵敏的检测肉制品羊源性成分提供一种新的选择，具有广阔的应用前景。
[0026]本研究旨在提高肉制品羊源性成分检测方法的可操作性，建立健全肉制品动物源性的检测方法，项目组针对羊肉制品建立专属性多酶恒温快速扩增可视化技术——多酶恒温侧流式扩增技术(MIRA
‑
LFD)检测方法，为监管部门提供羊源性成分现场检测技术手段。
[0027]显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0028]以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。
附图说明
[0029]图1为羊(AF010406)源性目的序列比对。
[0030]图2为羊源性引物阳性对照筛选结果。
[0031]图3为羊源性引物探针空白对照筛选结果。
[0032]图4为羊源性引物探针阴性对照筛选结果。
[0033]图5为羊源性引物探针阴性对照筛选结果。
[0034]图6为MIRA
‑
LFD检测体系引物探针体积筛选结果。
[0035]图7为不同温度条件下MIRA
‑
LFD实验结果图。
[0036]图8为不同反应时间下MIRA
‑
LFD实验结果图。
[0037]图9为羊源性成分荧光定量PCR检出限结果。
[0038]图10为羊源性成分MIRA
‑
LFD检测方法检出限。
[0039]图11为羊源性成分灵敏度考察。
[0040]图12为羊源性成分特异性考察。
[0041]图13为羊源性成分假阳性、假阴性考察。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鉴别肉制品中羊源性成分的引物探针组合，其特征在于：它包括正向引物、反向引物和探针；所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。2.权利要求1所述的引物探针组合在鉴别肉制品中羊源性成分的用途。3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述用途为在制备鉴别肉制品中羊源性成分的试剂盒中的用途。4.根据权利要求2或3所述的用途，其特征在于：所述鉴别肉制品中羊源性成分的方法为多酶恒温快速扩增可视化技术。5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述多酶恒温快速扩增可视化技术为多酶恒温快速扩增技术结合侧向流层析技术。6.一种鉴别肉制品中羊源性成分的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的引物探针组合。7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述鉴别肉制品中羊源性成分的方法为多酶恒温快速扩增可视化技术。8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述多酶恒温快速扩增可视化技术为多酶恒温快速扩增技术结合侧向流层析技...

【专利技术属性】
技术研发人员：张彪，杨华雨，尚柯，万渝平，张敏，李瑶，欧明月，
申请(专利权)人：成都市食品检验研究院，
类型：发明
国别省市：