一种可在外泌体表面进行轴突靶向修饰的递送复合物及其对外泌体的修饰方法技术

本发明专利技术提供一种可在外泌体表面进行轴突靶向修饰的递送复合物及其对外泌体的修饰方法，所述递送复合物由TAxI多肽和DSPE

【技术实现步骤摘要】
一种可在外泌体表面进行轴突靶向修饰的递送复合物及其对外泌体的修饰方法
[0001]

[0002]本专利技术属于生物
，具体涉及一种可在外泌体表面进行轴突靶向修饰的递送复合物及其制备方法以及该递送复合物修饰外泌体的方法。

技术介绍

[0003]神经系统退行性疾病（Neurodegenerative Disease,NDD）是由神经元和神经髓鞘的丧失所致，随着时间的推移而恶化，出现功能障碍，主要有脑萎缩、阿尔茨海默病、帕金森综合征、多发性硬化症及肌肉萎缩侧索硬化等。随着老龄化人口增多，该疾病对患者的寿命和生存质量的影响也越来越严重。
[0004]靶向性轴突导入（Targeted Axonal Import ，TAxI）多肽已经被科学家通过噬菌体展示技术证实，有着良好的中枢神经系统轴突靶向性，但其在血液中稳定性极低，并且在轴突的溶解度有待提高。DSPE
‑
PEG2000（1,2
‑
二硬脂酰基
‑
sn
‑
甘油
‑3‑
磷酸乙醇胺
‑
聚乙二醇2000）是一种生物相容性高、可生物降解的两亲性材料，可用于多种生物大分子（如，功能性多肽与蛋白）功能化以实现特定功能，在药物递送系统应用中广泛使用的活化脂
‑
磷脂
‑
聚乙二醇共轭物。
[0005]外泌体是有150nm左右的纳米级粒径，具有穿越血脑屏障的能力和良好的免疫调节功能，已有许多文章表明，干细胞外泌体在治疗神经退行性系统疾病时有着较于传统药物更好的疗效。外泌体适用于静脉内递送，但其临床转化进程受阻的主要原因是外泌体的生物利用率过低，进入体内后由于脉管系统的渗透性和保留（EPR）效应，大部分被肝、脾等器官降解吸收。
[0006]鉴于此，急需解决外泌体的靶向性问题，提高外泌体的生物利用率，使其应用到神经系统疾病的治疗中，对于解决临床神经系统退行性疾病尤为重要。

技术实现思路

[0007]针对现有技术的不足，本申请专利技术人对TAxI多肽的原序列片段进行优化，使其有更好的溶解度、血液稳定性以及便于体内示踪，并通过优化序列上的赖氨酸的氨基DSPE
‑
PEG2000
‑
NHS发生取代反应来接合到一起，获得靶向轴突的递送复合物，再通过控制温度和超声频率来使靶向轴突的递送复合物整合到外泌体膜表面，使被修饰外泌体具有轴突靶向功能。为实现本专利技术目的所使用的技术方案为：一种可在外泌体表面进行轴突靶向修饰的递送复合物，所述递送复合物由TAxI多肽和DSPE
‑
PEG2000
‑
NHS制成；所述TAxI多肽由SEQ ID NO：1所示序列的两端各加入一个三赖氨酸嵌段并在两个半胱氨酸间形成二硫键制成；所述TAxI多肽在C端赖氨酸接Biotin，所述TAxI多肽在N端赖氨酸与DSPE
‑
PEG2000
‑
NHS接枝。
[0008]本专利技术中靶向轴突的TAxI多肽片段的原序列为（SACQSQSQMRCGGG）（SEQ ID NO：1），为保证其溶解性，将在序列的两端各加三赖氨酸嵌段,同时在N端赖氨酸上的氨基也将作为TAxI多肽的接枝点与DSPE
‑
PEG2000
‑
NHS的NHS活性酯进行酰胺反应完成接枝,C端赖氨酸接生物素（Biotin）用于示踪；另外，为了保证多肽的血液稳定性，将在多肽序列中两个半胱氨酸的巯基之间形成二硫键使多肽形成环化结构。最后用反相高效液相色谱法（RP
‑
HPLC）对脱盐后的多肽溶液进行浓缩和纯化，获得（KKKSACQSQSQMRCGGGKKK(Biotin)
‑
OH 二硫键6
‑
14）（SEQ ID NO：2）多肽片段，并通过高效液相色谱法（HPLC）和质谱法（MS）对其进行鉴定。
[0009]本专利技术中二棕榈酰磷脂酰乙醇胺
‑
聚乙二醇
‑
琥珀酰亚胺酯（DSPE
‑
PEG2000
‑
NHS），分子式为C139H271N4O57P，PEG分子量：2000，整体分子量：2900。结构式为：DSPE
‑
PEG2000
‑
NHS是一种线性异双功能聚乙二醇化试剂，含有DSPE磷脂和活化的羧酸NHS酯。它是一种自组装试剂，用于制备聚乙二醇化脂质体或胶束，同时还提供NHS基团用于与含胺分子共轭，可提供隐身性，延长循环半衰期，减少经其修饰的外泌体与非特异性蛋白质结合或细胞粘附。将TAxI多肽片段的N端赖氨酸上的氨基作为接枝点，通过赖氨酸上的氨基与DSPE
‑
PEG2000
‑
NHS上的NHS基团之间的共价共轭作用生成了酰胺键，最终合成了DSPE
‑
PEG2000
‑
TAxI
‑
biotin线性靶向轴突的递送复合物，用于外泌体的膜表面靶向修饰。
[0010]本专利技术还提供一种轴突靶向递送复合物修饰外泌体的方法，利用上述递送复合物对干细胞外泌体进行表面修饰而成；所述递送复合物预先制成DSPE
‑
PEG2000
‑
TAxI
‑
Biotin胶束；所述DSPE
‑
PEG2000
‑
TAxI
‑
Biotin胶束和外泌体的质量比为1:1 (按
µ
g蛋白:
µ
g蛋白)。
[0011]优选地，所述外泌体为人脐带间充质干细胞外泌体、血液外泌体、唾液外泌体或尿液外泌体的任意一种。
[0012]外泌体膜表面的DSPE
‑
PEG2000
‑
TAxI插入修过程，专利技术人将DSPE
‑
PEG2000
‑
TAxI
‑
biotin与外泌体通过一系列温度变化和超声振荡条件下的共孵育来进行。另外，通过DiR染料对轴突靶向递送复合物修饰的外泌体进行膜标记，也可以通过染料标记（如，HRP、FITC等）的链霉亲和素蛋白嵌合体与DSPE
‑
PEG2000
‑
TAxI
‑
Biotin中的生物素偶联组成生物反应放大系统来对DSPE
‑
PEG2000
‑
TAxI
‑
biotin进行标记。
[0013]优选地，具体制备步骤如下：（1）合成TAxI多肽；（2）将AxI多肽和DSPE
‑
PEG2000
‑
NHS的接合，获得递送复合DSPE
‑
PEG2000
‑
TAxI
‑
Biotin；（3）将步骤（2）合成的递送复合物制成胶束，再插入外泌体脂双层膜中。
[本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可在外泌体表面进行轴突靶向修饰的递送复合物，其特征在于，所述递送复合物由TAxI多肽和DSPE
‑
PEG2000
‑
NHS制成；所述TAxI多肽由SEQ ID NO：1所示序列的两端各加入一个三赖氨酸嵌段制成；所述TAxI多肽在C端赖氨酸接Biotin，所述TAxI多肽在N端赖氨酸与DSPE
‑
PEG2000
‑
NHS接枝。2.根据权利要求1所述的可在外泌体表面进行轴突靶向修饰的递送复合物，其特征在于，所述TAxI多肽的序列如SEQ ID NO：2所示。3.根据权利要求1或2所述的可在外泌体表面进行轴突靶向修饰的递送复合物，其特征在于，所述TAxI多肽的两个半胱氨酸间形成二硫键使多肽环化。4.根据权利要求1所述的可在外泌体表面进行轴突靶向修饰的递送复合物，其特征在于，所述DSPE
‑
PEG2000
‑
NHS的结构式为：。5.权利要求4所述的可在外泌体表面进行轴突靶向修饰的递送复合物，其特征在于，所述DSPE
‑
PEG2000
‑
NHS的分子式为C139H271N4O57P，分子量为2900。6.一种轴突靶向递送复合物修饰外泌体的方法，其特征在于，由权利要求1的递送复合物对干细胞外泌体进行表面修饰而成；所述递送复合物预先制成DSPE
‑
PEG2000
‑
TAxI
‑<...

【专利技术属性】
技术研发人员：王迎凯，齐忠权，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：