一种核桃楸黄酮提取及纯化工艺制造技术

本发明专利技术提供了一种核桃楸黄酮提取及纯化工艺，及所制备的黄酮组分纳米乳在癌症治疗中应用。本发明专利技术中，核桃楸废枝黄酮类组分纳米乳的制备工艺较为简单，所得纳米制剂的平均粒径为20

【技术实现步骤摘要】
性剂为乙醇、丙二醇、丙三醇、PEG400。结果表明，乙醇、丙二醇和PEG均可以形 成纳米乳，通过伪三元相图最终PEG400作为助表面活性剂。
[0029](4)Km值筛选
[0030]Km值是表面活性剂质量与助表面活性剂质量的比值，根据预试验结果分别考察 Km值为3:1、2:1、1:1时纳米乳的形成区域大小。结果表明，Km为3:1时，形成的 纳米乳区域最小，Km为2:1和1:1时纳米乳区域面积相差较小，但在实验过程中发现 Km为2:1时容易形成凝胶，所以最终选定表面活性剂质量与助表面活性剂质量的比 值为1:1。
[0031](5)最优处方的确定
[0032]根据(4)中Km为1:1时的伪三元相图，首先确定4个备选处方的S/O(混合表 面活性剂和油相的质量比)分别为8.5/1.5、8/2、7.5/2.5和7/3，然后用电导仪测定含 水量和电导率的关系，确定纳米乳的类型，同时确定纳米乳中的含水量。结果表明， 四个备选处方随着含水量的增加，电导率变化趋势基本一致，在含水量达到70％以后， 电导率均开始下降，此时可以认为纳米乳为O/W型，因此选择水相含量为80％，通 过测量各备选处方在含水量为80％时的粒径和PDI，选择S/O(混合表面活性剂和油 相的质量比)为8/2。最终优化得到纳米乳处方为：表面活性剂(吐温80和司盘80 复配，比例为4.6：1)与助表面活性剂(PEG400)比例为1：1，两者在体系中含量 为16％；油相为肉豆蔻酸异丙酯(IPM)，含量为4％；水相为蒸馏水，含量为80％；
[0033]实施例2：核桃楸皮黄酮组分纳米乳的表征
[0034](1)核桃楸废枝黄酮组分纳米乳制备
[0035]根据优化得到的处方制成空白纳米乳后，取10g空白纳米乳缓慢向其加入核桃楸 废枝黄酮纯化物170mg，搅拌使之完全溶解，制成含量为17mg/g的核桃楸废枝黄酮 组分纳米乳。
[0036](2)核桃楸废枝黄酮组分纳米乳制剂的粒径分析
[0037]乳滴的粒径是纳米乳重要的特性参数，是评价纳米乳的稳定性的最重要性质之一， 采用激光粒度分析仪对样品进行粒径测定。结果表明，核桃楸废枝黄酮组分纳米乳的 平均粒径为22.5nm。
[0038](3)核桃楸废枝黄酮组分纳米乳制剂的染色分析
[0039]通过染色法鉴定纳米乳类型，取两份纳米乳液，各滴加相同体积的水性染料亚甲 蓝和油性染料苏丹红，观察两种染料在纳米乳中的扩散情况，结果表明，亚甲蓝的扩 散速度明显高。于苏丹红染料，说明制备的纳米乳液是水包油型的。
[0040](4)核桃楸废枝黄酮组分纳米乳制剂的稳定性分析
[0041]取核桃楸废枝黄酮纳米乳，分别于4℃、室温避光光放置30天，于0、5、10、 15、20、30天取出，观察外观及测定纳米乳粒径。结果表明核桃楸废枝黄酮纳米乳在 常温和4℃的储存环境下，具有良好的稳定性。
[0042]实施例3：核桃楸皮黄酮组分纳米乳的抗肝癌作用研究
[0043](1)细胞株来源及培养方法
[0044]按照常规方法培养HepG2和HL02细胞，具体地，在含有青霉素/链霉菌(1％) 和胎牛血清(10％)的DMEM培养基中，在37℃、5％CO2的培养箱中进行常规培 养。
[0045](2)核桃楸皮黄酮组分纳米乳对HepG2细胞形态的影响
[0046]选用生长对数期的HepG2细胞，以每孔3
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105个细胞的接种在6孔板中，培养箱 中培养24h，随即弃液。经不同浓度核桃楸皮黄酮组分纳米乳(40、80、120μg/mL) 处理48h后，在倒置显微镜下观察细胞形态，黄酮浓度为0μg/mL时，细胞呈紧密排 列有规则的多边形，随着药物浓度提高，细胞排列变为松散，细胞拉长，呈不规则的 多边形或三角形，细胞内产生大量的空泡。
[0047](3)核桃楸皮黄酮组分纳米乳对HepG2细胞增殖的影响
[0048]使用CCK8检测不同浓度纳米乳(10、20、40、60、80、100、120、140μg/mL) 对HepG2细胞增殖的影响，结果可知纳米乳对HepG2增殖的抑制作用存在剂量依赖 性，其在24h和48h的IC50分别为119.0μg/mL和49.21μg/mL。
[0049](4)核桃楸皮黄酮组分纳米乳对HepG2细胞迁移的影响
[0050]采用划痕试验考察纳米乳对HepG2细胞迁移的影响。结果表明，核桃楸皮黄酮 组分纳米乳可以抑制HepG2细胞的迁移，其处理浓度越大，抑制率也越大。
[0051](5)核桃楸皮黄酮组分纳米乳对HepG2细胞凋亡的影响
[0052]采用流式细胞仪检测纳米乳对HepG2细胞凋亡的影响，结果表明，随着核桃楸 皮黄酮组分纳米乳浓度的增加，细胞凋亡率也在增加，说明桃楸皮黄酮组分纳米乳可 以诱导HepG2细胞的凋亡。
[0053](6)核桃楸皮黄酮组分纳米乳对HL02细胞和增殖的影响
[0054]使用CCK8检测纳米乳对正常肝细胞HL02细胞毒性情况。结果表明，核桃楸皮 黄酮组分纳米乳对HL02细胞并无明显毒性，核桃楸皮黄酮组分纳米乳在细胞水平是 比较安全的。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种核桃楸黄酮提取及纯化工艺，包括以下步骤：(1)在45℃条件下将核桃楸废枝烘干至恒重，然后经粉碎机粉碎，过60目筛，得到核桃楸废枝粉末；(2)称取步骤(1)得到的核桃楸废枝粉末适量，加入提取溶剂，采用超声波辅助提取黄酮类化合物；提取结束后，离心收获上清液，即为核桃楸废枝黄酮类化合物的粗提液；其中，所述的提取溶剂为68％(V/V)乙醇溶液；(3)将步骤(2)得到的上清液进行旋转蒸发浓缩，得到核桃楸废枝黄酮类化合物的粗提物。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中向过筛后的核桃楸废枝干粉中加入68％的乙醇溶液，使其料液比为1：20g/mL，超...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜林娜，林瑞新，初国栋，万辰梦，杨晶，
申请(专利权)人：吉林农业大学，
类型：发明
国别省市：