单管检测多个待测目标核酸序列方法及其试剂盒技术

本发明专利技术提供单管检测多个待测目标核酸序列的方法及其试剂盒，所述方法利用PCR扩增产物的熔点Tm值实现，所述方法包括：针对每个待测目标核酸序列设计特异性探针和下游引物，所述特异性探针一部分作为特异性上游引物；退火时，所述探针及下游引物分别与各自待测目标核酸序列特异性结合，形成杂交双链，且在所述RNA碱基处形成DNA

【技术实现步骤摘要】
值在50
‑
70℃，所述探针的Tm值范围为60～80℃，只需针对待测序列设计探针和下游引 物，即可完成检测和扩增，降低扩增体系中的序列的数量，降低不同序列间多聚体形成， 具有高的灵敏度和特异性。
[0022]2).在现有的荧光定量PCR扩增中，退火温度和延伸温度通常是同一个温度，而在 本专利技术中通过设置反应程序中的不同的退火温度和延伸温度(延伸温度高于退火温度)， 降低序列二聚体的形成和扩增，提高特异性。
[0023]3).利于RNaseH酶切获得带荧光标记的引物，扩增形成带荧光基团的产物，直接对 特异性产物进行熔解曲线分析，具有优异的特异性；
[0024]4).利用荧光定量PCR仪的不同个通道和不同产物的Tm差异二维参数，实现多靶 标核酸的多重检测，提高检测准确率，节省时间和成本以及样本量。
[0025]5).整个过程闭管操作，避免扩增污染。
附图说明
[0026]为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附 图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例， 对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获 得其它的附图。
[0027]图1是本专利技术方法的原理示意图；
[0028]图2是本专利技术方法单管检测八个靶标的扩增产物熔解曲线图；
[0029]图3是本专利技术方法单管检测十个靶标的扩增产物熔解曲线图；
[0030]图4是不同退火温度和延伸温度组合的扩增产物溶解曲线图。
具体实施方式
[0031]为了使本领域
人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合实施例对 本专利技术作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部 的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下 所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。
[0032]下述实施例中，如无特殊说明，均为本领域常规方法。标准质粒的提取试剂盒购自 北京天根生物科技有限公司。
[0033]实施例一 本专利技术方法的基本原理
[0034]如图1所示，本专利技术提供一种单管检测多个待测目标核酸序列的方法，所述方法利 用PCR扩增产物的熔点Tm值实现，所述方法包括以下步骤：
[0035]步骤1：针对每个待测目标核酸序列设计特异性探针和下游引物，所述特异性探针一 部分作为特异性上游引物，控制所述特异性上游引物的Tm值在50
‑
70℃，所述探针的 Tm值范围为60～80℃，通过对每个待测目标核酸序列的荧光产物熔点Tm值的控制，使 得同一荧光标记通道内不同的待测目标核酸序列的荧光产物熔点Tm值通过PCR仪能够 区分；所述探针含至少1个RNA碱基，在所述RNA碱基左侧靠近所述探针5
’
端一侧 的探针碱基上标记荧光基团，在所述RNA碱基靠近所述探针3
’
端一侧的探针碱基上标 记淬灭基团；在所述RNA碱基的左侧所述探针片段熔点Tm值高于在所述RNA碱基的 右侧所述探针片段熔点Tm值；
[0036]步骤2：退火时，所述探针及下游引物分别与各自待测目标核酸序列特异性结合，形 成杂交双链，且在所述RNA碱基处形成DNA
‑
RNA杂交链；
[0037]步骤3：在耐热核糖核酸酶RNaseH工作温度下，所述耐热核糖核酸酶RNaseH切割 与待测核酸序列结合的RNA碱基，使得RNA碱基左侧的含有荧光基团的片段仍然保持 形成杂交链，而在所述RNA碱基右侧的含有淬灭基团的探针片段游离出去；
[0038]步骤4：在退火温度的基础上，升高温度到达延伸温度，在此温度下聚合酶以RNA 碱基左侧的含有荧光基团的片段作为上游引物进行延伸，生成待测目标核酸序列的带荧 光标记的PCR产物；
[0039]步骤5：通过不同待测目标核酸序列的带荧光标记的PCR产物的Tm差异和/或不同 的荧光标记，实现多个待测目标核酸序列的多重检测。
[0040]实施例2：常见性病病原体的检测
[0041]一、引物、探针的设计
[0042]根据各待测核酸序列保守区域设计下游引物和带一个RNA碱基的探针。具体序列信 息详见表1。
[0043]表1常见性病病原体检测引物和探针及荧光产物Tm值
[0044][0045][0046]按照上表中选择各靶标病原菌的菌株的引物、探针，检测100CFU/mL菌株样品。
[0047]二、PCR扩增反应条件和程序
[0048]95℃预变性10分钟；95℃变性15秒，58℃退火，72℃延伸，同时延伸时收集荧光， 重复45个循环；40
‑
95℃熔解曲线分析，每隔0.04℃检测一次荧光信号，60℃降温1分 钟。
[0049]三、检测结果
[0050]结果如图2和图3，通过探针和下游引物可以实现对21个靶标(19种病原体+2个 内参质控)检测，图2和图3表明均可检测到各靶标的100CFU/mL菌株。
[0051]图2中是单管8重反应体系的结果，图2A是HEX通道，其中A1表示热带念珠菌、 A2表示光滑念珠菌、A3表示白色念珠菌、A4表示阴沟肠杆菌；图2B是ROX通道，其 中B1表示粪肠球菌；图2C是CY5通道，其中C1表示金黄色葡萄球菌、C2表示粘质 沙雷菌；图2D是FAM通道，其中D1表示奇异变形杆菌、D2表示肺炎克雷伯菌。从以 上检测结果可看出，图2中该八重体系检测8种目标序列的混合质粒时，每种病原体均 有对应的特征熔解峰，说明建立的八重体系能够准确检测常见的性病病原体。
[0052]图3中是单管10重反应体系的结果，图3A是HEX通道，A1表示无乳链球菌、A2 表示鲍曼不动杆菌、A3表示表皮葡萄球菌；图3B是ROX通道，ROX通道的B1表示 近平滑念珠菌、B2表示屎肠球菌、B3表示铜绿假单胞菌；图3C是CY5通道，CY5通 道的C1表示克柔念珠菌、C2表
意欲限制本专利技术的范围，本专利技术的范围仅受限于所附的权利要求。
[0065]本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的 本专利技术的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.单管检测多个待测目标核酸序列的方法，其特征在于，所述方法利用PCR扩增产物的熔点Tm值实现，所述方法包括以下步骤：步骤1：针对每个待测目标核酸序列设计特异性探针和下游引物，所述特异性探针一部分作为特异性上游引物，控制所述特异性上游引物的Tm值在50
‑
70℃，所述探针的Tm值范围为60～80℃，通过对每个待测目标核酸序列的荧光产物熔点Tm值的控制，使得同一荧光标记通道内不同的待测目标核酸序列的荧光产物熔点Tm值通过PCR仪能够区分；所述探针含至少1个RNA碱基，在所述RNA碱基左侧靠近所述探针5
’
端一侧的探针碱基上标记荧光基团，在所述RNA碱基靠近所述探针3
’
端一侧的探针碱基上标记淬灭基团；在所述RNA碱基的左侧所述探针片段熔点Tm值高于在所述RNA碱基的右侧所述探针片段熔点Tm值；步骤2：退火时，所述探针及下游引物分别与各自待测目标核酸序列特异性结合，形成杂交双链，且在所述RNA碱基处形成DNA
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RNA杂交链；步骤3：在耐热核糖核酸酶RNaseH工作温度下，所述耐热核糖核酸酶RNaseH切割与待测核酸序列结合的RNA碱基，使得RNA碱基左侧的含有荧光基团的片段仍然保持形成杂交链，而在所述RNA碱基右侧的含有淬灭基团的探针片段游离出去；步骤4：在退火温度的基础上，升高温度到达延伸温度，在此温度下聚合酶以RNA碱基左侧的含有荧光基团的片段作为上游引物进行延伸，生成待测目标核酸序列的带荧光标记的PCR产物；步骤5：通过不同待测目标核酸序列的带荧光标记的PCR产物的Tm差异和/或不同的荧光标记，实现多个待测目标核酸序列的多重检测。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述延伸温度为高于所述退火温度5～20℃。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述延伸温度高于所述退火温度10～15℃。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过控制所述探针和所述下游引物之间的序列长度实现对每个待测靶标核酸序列的Tm值控制，使得同一荧光标记通道内不同的待测目标核酸序列的荧光产物熔点Tm值在荧光PCR仪上能够区分。5.根据权利要求4所述的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯华华，杨红雷，陶海霞，胡小许，常沙沙，王玲娟，赵佩佩，刘利成，
申请(专利权)人：江苏宏微特斯医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：