包含可光切割蛋白的外排体及其用途制造技术

本发明专利技术涉及包含可光切割蛋白的外排体及其用途。根据本发明专利技术的外排体包含含有蓝色荧光蛋白(TagBFP)、可光切割蛋白(mMaple3)和外排体特异性标志物蛋白(CD9)的融合蛋白，并且确定了，当对外排体发射405nm的光时，作为可光切割蛋白的mMaple3被切割使得外排体中的蓝色荧光蛋白可被递送到靶细胞中。另外，确定了，当向包含Cre融合蛋白(Cre

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含可光切割蛋白的外排体及其用途


[0001]本公开内容涉及包含可光切割蛋白的外排体及其用途，并且更具体地，涉及包含含有靶蛋白和可光切割蛋白(mMaple3)的融合蛋白的外排体及其用途。
[0002]本申请要求基于于2020年2月10日提交的韩国专利申请No.10
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2020
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0015696和于2021年2月4日提交的韩国专利申请No.10
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2021
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0015837的优先权，并且公开在相应申请的说明书和附图中的全部内容均并入本申请。

技术介绍

[0003]大多数当前的蛋白质治疗靶向细胞膜蛋白。然而，许多疾病的致病因子主要存在于细胞内部，并且为了靶向这些致病因子，需要用于将治疗性蛋白质递送到细胞中的技术。
[0004]因此，最近研究了许多用于将靶蛋白直接引入到细胞中的方法，并且这些中之一，即使用脂质纳米粒递送治疗性蛋白质的技术，其问题在于脂质纳米粒不能有效地与治疗性蛋白质分离；以及用于使用在病毒的胞内穿透过程中发挥主要作用的蛋白质转导结构域(Protein Transduction Domain，PTD)进行递送的技术，其问题在于蛋白质转导结构域在暴露于体液(例如血液或肠液)时被降解。
[0005]因此，需要用于将治疗性蛋白质有效地递送至细胞内部的技术，以便靶向存在于细胞内部的特定疾病的致病因子。
[0006]在另一方面，外排体是由脂质双层构成的囊泡，并且是细胞分泌至细胞外部的物质的组成成分。为了在介导细胞r/>‑
细胞通讯和细胞免疫中发挥功能性作用，已知外排体发挥运输(递送)蛋白质、生物活性脂质和RNA(miRNA)(其均是细胞中的生物分子)的作用。这种外排体也正在作为神经系统疾病(例如阿尔茨海默病等)的生物标志物而被研究，并且还用于开发药物递送系统，例如特定药物的纳米载体，这归因于足以穿透分隔脑脊液与血液的血脑屏障(blood
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brain barrier，BBB)的高选择性透过性。
[0007]关于用于递送治疗性蛋白质的技术，韩国专利公开No.10
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2018
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0036134公开了用于使用光特异性结合蛋白来制备包含超阻遏物
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Iκ蛋白的外排体的方法，以及用于预防和治疗炎性疾病的药物组合物，其包含通过所述制备方法制备的外排体作为活性成分；以及日本专利申请公开No.2019
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528674公开了用于大量生产包含载物蛋白的外排体的方法、用于制备外排体的载体、通过所述方法制备的包含载物蛋白的外排体以及用于通过使用由此制备的外排体将载物蛋白装载在细胞溶胶的方法。
[0008]然而，上述文件公开了光特异性结合蛋白作为外排体中融合蛋白的组分，并且这使用了两种光特异性结合蛋白如CIBN
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CRY2系统，因此当两种构建体在细胞中表达时，则必须将这两种构建体共转染，并因此效率降低，并且在产生外排体的同时必须向细胞连续施加488nm的光，因此其可影响细胞，并且会发生外排体中所含运载蛋白的量的损失。另外，存在以下缺点：当外排体形成之后，在不存在光的条件下维持CIBN和CRY2的结合时，运载蛋白不能自由移动，并且可与外排体特异性蛋白质结合；待融合到运载蛋白的CRY2的尺寸大到65kDa，因此其可影响运载蛋白的固有功能；以及为了确定其在细胞内是否良好表达，必须
单独融合和使用荧光蛋白(例如EGFP)，以及因此无法确定CRY2和CIBN的结合在没有给予光时是否脱落。
[0009]因此，本专利技术人试图克服使用CIBN
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CRY2系统的常规已知蛋白质递送技术的缺点，并且开发用于将蛋白质安全且有效地递送到细胞中的方法。

技术实现思路

[0010]技术问题
[0011]本专利技术人发现，当向含有其中可光切割蛋白mMaple3与待递送到细胞中的靶蛋白组合的融合蛋白的外排体辐照光时，mMaple3被切割以将外排体中的靶蛋白安全且有效地释放到靶细胞中，从而在此基础上完成了本公开内容。
[0012]因此，本公开内容的一个目的是提供包含含有靶蛋白、可光切割蛋白和外排体特异性标志物蛋白的融合蛋白的外排体及其用途。
[0013]然而，本公开内容实现的技术问题不限于前述问题，并且本公开内容中所属领域的技术人员从以下描述可清楚地理解未提及的其他问题。
[0014]技术方案
[0015]为了实现上述目的，本公开内容提供了包含含有靶蛋白和mMaple3的融合蛋白的外排体。
[0016]另外，本公开内容提供了用于将靶蛋白递送到细胞中的组合物，其包含外排体作为活性成分。
[0017]此外，本公开内容提供了用于在体外将靶蛋白递送到细胞中的方法，其包括向包含含有靶蛋白和mMaple3的融合蛋白的外排体辐照光；以及
[0018]用经光辐照的外排体处理靶细胞。
[0019]此外，本公开内容提供了用于递送到细胞中的蛋白质候选药物的筛选方法，其包括(a)向包含含有蛋白质候选药物和mMaple3的融合蛋白的外排体辐照光；
[0020](b)用经光辐照的外排体处理靶细胞；以及
[0021](c)当mMaple3在靶细胞中表现出荧光时，则确定所述蛋白质候选药物被递送到细胞中。
[0022]作为本公开内容的一个实施方案，融合蛋白还可包含外排体特异性标志物蛋白。
[0023]另外，本公开内容提供了用于制备融合蛋白的方法，其包括以下步骤：
[0024](S1)分别扩增靶蛋白和mMaple3的cDNA；
[0025](S2)将靶蛋白和mMaple3的扩增cDNA组合成一条cDNA，以制备编码包含靶蛋白和mMaple3的融合蛋白的cDNA；以及
[0026](S3)通过将编码融合蛋白的cDNA引入到载体中并随后将其转染到细胞中来表达融合蛋白。
[0027]此外，本公开内容提供了用于制备外排体的方法，其包括以下步骤：
[0028](S1)分别扩增靶蛋白和mMaple3的cDNA；
[0029](S2)将靶蛋白和mMaple3的扩增cDNA组合成一条cDNA，以制备编码包含靶蛋白和mMaple3的融合蛋白的cDNA；以及
[0030](S3)将编码融合蛋白的cDNA转染到外排体产生细胞中，并从细胞培养基中分离和
纯化外排体。
[0031]作为本公开内容的一个实施方案，其可包括于在(S2)中将靶蛋白和mMaple3的扩增cDNA组合成一条cDNA之前，将mMaple3的扩增cDNA和外排体特异性标志物蛋白的cDNA组合成一条cDNA。
[0032]作为本公开内容的另一个实施方案，(S3)中对外排体的分离可使用选自TFF(tangential flow filtration，切向流过滤)、超速离心、尺寸排阻色谱和外排体分离试剂盒中的一种方法。
[0033]作为本公开内本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.外排体，其包含含有靶蛋白和mMaple3的融合蛋白。2.根据权利要求1所述的外排体，其中所述mMaple3包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。3.根据权利要求1所述的外排体，其中所述mMaple3由包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列的基因编码。4.根据权利要求1所述的外排体，其中所述融合蛋白还包含外排体特异性标志物。5.根据权利要求1所述的外排体，其中所述靶蛋白待被递送到细胞中。6.根据权利要求5所述的外排体，其中所述靶蛋白用于治疗疾病或用于诊断疾病。7.根据权利要求4所述的外排体，其中所述外排体特异性标志物是选自CD9、CD63和CD81中的一种或更多种。8.用于将靶蛋白递送到细胞中的组合物，其包含根据权利要求1至7中任一项所述的外排体作为活性成分。9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述靶蛋白待被递送到细胞中。10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述靶蛋白用于治疗疾病或用于诊断疾病。11.制备权利要求1所述的融合蛋白的方法，其包括以下：(S1)分别扩增靶蛋白和mMaple3的cDNA；(S2)将所述mMaple3的扩增cDNA与所述靶蛋白的扩增cDNA组合成一条链，以制备编码包含所述靶蛋白和所述mMaple3的融合蛋白的cDNA；以及(S3)通过将编码所述融合蛋白的cDNA引入到载体中并随后将其转染到细胞中来表达所述融合蛋白。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述方法还包括：于在(S2)中将所述mMaple3的扩增cDNA与所述靶蛋白的扩增cDNA组合成一条链之前，将所述mMaple3的扩增cDNA与外排体特异性标志物的cDNA组合成一条链。13.制备权利要求1所述的外排体的方法，其包括以下：(S1)分别扩增靶蛋白和mMaple3的cDNA；(S2)将所述mMaple3的扩增cDNA与所述靶蛋白的扩增cDNA组合成一条链，以制备编码包含所述靶蛋白和所述mMaple3的融合蛋白的cDNA；以及(S3)将...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵洞奎，韩智勋，薛在勋，
申请(专利权)人：胞外体干细胞株式会社，
类型：发明
国别省市：