用于靶向核酸捕获的系统和方法技术方案

本公开提供了用于模板的靶向间接、协同杂交捕获以用于靶序列的扩增和分析的系统和方法。捕获的模板可以用亚硫酸氢盐或其他甲基化试剂进一步处理，以研究模板核酸分子的甲基化模式。模式。模式。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于靶向核酸捕获的系统和方法
交叉引用
[0001]本申请要求于2020年1月31日提交的美国临时申请号62/968,847、于2020年3月9日提交的美国临时申请号62/987,232和于2020年3月12日提交的美国临时申请号62/988,859的权益，这些申请通过引用并入本文。
[0002]本申请与以下共同未决专利申请有关：于2019年11月20日提交的国际申请号PCT/US2019/062508，其通过引用并入本文。

技术介绍

[0001]核酸靶标捕获方法可以使特定基因、外显子和其他目的基因组区域富集，例如用于靶向测序。然而，基于靶标捕获的测序方法可能涉及繁琐冗长的方案和昂贵的过程，以及小型捕获基因包(panel)(例如，少于500个探针)的低中靶率。此外，由于回收率低，目前的核酸靶标捕获方法可能不适合低输入和受损的DNA。
[0002]亚硫酸氢盐转化可以是研究核酸分子甲基化模式的有用技术。然而，亚硫酸氢盐转化可以通过例如产生截断的方式损坏核酸。如果用亚硫酸氢盐处理二代测序(NGS)DNA文库，则大量核酸可能被破坏并且无法在后续的扩增步骤中回收，从而提供低回收率。此外，由于亚硫酸氢盐转化可以产生单链或片段化DNA并降低序列复杂性，因此转化的DNA可能是传统的基于衔接子连接的文库构建的困难输入。考虑到低回收率(例如，亚硫酸氢盐处理的cfDNA为5％或更低)，初始输入通常较小的亚硫酸氢盐处理的无细胞DNA(cfDNA)或循环肿瘤细胞DNA(ctDNA)可能带来更大的挑战。还可以进行甲基化敏感酶处理以转化甲基化胞嘧啶。然而，基于酶的方法仍然会在漫长的多步骤过程中遭受甲基化状态的丧失，导致回收率低。
[0003]无细胞DNA中的甲基化分析对于早期癌症检测具有巨大潜力。在早期癌症患者的血浆中，肿瘤含量估计低于0.1％，通常低至0.01％或更低，因此需要高灵敏度的检测。目前有两种主要的癌症筛查方法：全面方法，包括全基因组亚硫酸氢盐测序(WGBS)、简并代表性亚硫酸氢盐测序(RRBS)或基于亲和力的富集，以及含有10,000个或更多个潜在甲基化标志物的大型靶向基因包。靶向甲基化测序(TMS)提供对甲基化标志物最灵敏、特异性的分析。然而，传统TMS的灵敏度和特异性受靶标富集的低效率和低回收率的影响，并进一步受到与大型基因包相关的背景噪声的阻碍。需要使用小型、集中的癌症特异性甲基化生物标志物基因包进行深入分析的方法。
[0004]因此，需要更有效、易于使用、快速、灵活和实用的靶核酸捕获方法和改进的用于分析亚硫酸氢盐处理的核酸的方法，特别是对于低输入样本(例如cfDNA)。本文公开的方法可用于极低DNA输入样本的扩增前和亚硫酸氢盐转化前基于杂交的捕获。

技术实现思路

[0005]本文公开了一种方法，该方法包括：获得模板核酸分子，在该模板核酸分子的5'端或3'端包含衔接子；将第一桥接探针的第一靶特异性区域与模板核酸分子的第一靶序列杂
交，其中第一桥接探针的第一衔接子着陆序列与衔接子锚定探针的第一桥接结合序列结合；并且将第二桥接探针的第二靶特异性区域与模板核酸分子的第二靶序列杂交，其中第二桥接探针的第二衔接子着陆序列与衔接子锚定探针的第二桥接结合序列结合。方法可以进一步包括将衔接子附接至样本核酸分子的5'端或3'端，从而生成包含衔接子的模板核酸分子。方法可以进一步包括将衔接子附接至样本核酸分子的5'端或3'端，并且将衔接子分别附接至包含衔接子的模板核酸分子的3'端或5'端，从而生成在每一端包含衔接子的模板核酸分子。方法可以进一步包括将衔接子引物与附接至模板核酸分子的3'端的衔接子杂交，该模板核酸分子与第一桥接探针和第二桥接探针杂交；并且延伸衔接子引物的3'端，从而生成延伸产物。方法可以进一步包括对延伸产物进行测序。
[0006]在第一靶特异性区域杂交之前，第一桥接探针的第一衔接子着陆序列可以与衔接子锚定探针的第一桥接结合序列结合。在第一靶特异性区域杂交之后，第一桥接探针的第一衔接子着陆序列可以与衔接子锚定探针的第一桥接结合序列结合。在第二靶特异性区域杂交之前，第二桥接探针的第二衔接子着陆序列可以与衔接子锚定探针的第二桥接结合序列结合。在第二靶特异性区域杂交之后，第二桥接探针的第二衔接子着陆序列可以与衔接子锚定探针的第二桥接结合序列结合。
[0007]方法可以进一步包括将第一桥接探针的第一着陆序列与衔接子锚定探针的第一桥接结合序列杂交。方法可以进一步包括将第二桥接探针的第二着陆序列与衔接子锚定探针的第二桥接结合序列杂交。衔接子锚定探针可以进一步包含位于第一桥接结合序列和第二桥接结合序列之间的间隔子。衔接子可以包含分子条形码。
[0008]衔接子锚定探针可以包含结合部分。可以将结合部分附接至支持物。支持物可以是珠子。珠子可以是链霉亲和素珠子。结合部分可以是生物素。
[0009]第一桥接探针可以包含结合部分。可以将结合部分附接至支持物。支持物可以是珠子。珠子可以是链霉亲和素珠子。结合部分可以是生物素。
[0010]模板核酸分子可以包含单链DNA。模板核酸分子可以包含来自生物样本的无细胞核酸。无细胞核酸可以包含无细胞DNA。无细胞DNA可以包含循环肿瘤DNA。模板核酸分子可以包含受损的DNA。
[0011]本文公开了一种方法，该方法包括：将第一桥接探针的第一靶特异性区域与模板核酸分子的第一靶序列杂交，其中第一桥接探针的第一衔接子着陆序列与衔接子锚定探针的第一桥接结合序列结合；将第二桥接探针的第二靶特异性区域与模板核酸分子的第二靶序列杂交，其中第二桥接探针的第二衔接子着陆序列与衔接子锚定探针的第二桥接结合序列结合，从而生成与第一桥接探针和第二桥接探针杂交的模板核酸分子；并且在第一靶特异性区域杂交和第二靶特异性区域杂交之后，用甲基化测定试剂处理模板核酸分子。甲基化测定试剂可以是二硫化物，或修饰甲基化胞嘧啶的酶。方法可以进一步包括将第三桥接探针的第三靶特异性区域与模板核酸分子的第三靶序列杂交，其中第三桥接探针的第三衔接子着陆序列与衔接子锚定探针的第三桥接结合序列结合。方法可以进一步包括将第四桥接探针的第四靶特异性区域与模板核酸分子的第四靶序列杂交，其中第四桥接探针的第四衔接子着陆序列与衔接子锚定探针的第四桥接结合序列结合。
[0012]方法可以进一步包括在杂交第一桥接探针和杂交第二桥接探针之前，将衔接子附接至模板核酸分子的5'端或3'端。方法可以进一步包括将衔接子引物与附接至模板核酸分
子的3'端的衔接子杂交，该模板核酸分子与第一桥接探针和第二桥接探针杂交；并延伸衔接子引物的3'端，从而生成延伸产物。方法可以进一步包括对延伸产物进行测序。
[0013]衔接子引物的杂交可以在用亚硫酸氢盐处理之前进行。衔接子引物的杂交可以在用亚硫酸氢盐处理之后进行。衔接子引物可以基于亚硫酸氢盐处理之后的衔接子设计，其中衔接子中的非甲基化胞嘧啶在处理过程中转化为尿嘧啶。在第一靶特异性区域杂交之前，第一桥接探针的第一衔接子着陆序列可以与衔接子锚定探针的第一桥接结合序列结合。在第一靶特异本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种方法，所述方法包括：获得模板核酸分子，在所述模板核酸分子的5'端或3'端包含衔接子；将第一桥接探针的第一靶特异性区域与所述模板核酸分子的第一靶序列杂交，其中所述第一桥接探针的第一衔接子着陆序列与衔接子锚定探针的第一桥接结合序列结合；并且将第二桥接探针的第二靶特异性区域与所述模板核酸分子的第二靶序列杂交，其中所述第二桥接探针的第二衔接子着陆序列与所述衔接子锚定探针的第二桥接结合序列结合。2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括将所述衔接子附接至样本核酸分子的5'端或3'端，从而生成包含所述衔接子的模板核酸分子。3.根据权利要求2所述的方法，包括将所述衔接子附接至样本核酸分子的5'端或3'端，并且将衔接子分别附接至包含所述衔接子的所述模板核酸分子的3'端或5'端，从而生成在每一端包含衔接子的模板核酸分子。4.根据权利要求2或3所述的方法，进一步包括将衔接子引物与附接至所述模板核酸分子的3'端的衔接子杂交，所述模板核酸分子与所述第一桥接探针和所述第二桥接探针杂交；并且延伸所述衔接子引物的3'端，从而生成延伸产物。5.根据权利要求4所述的方法，进一步包括对所述延伸产物进行测序。6.根据权利要求1
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5中任一项所述的方法，其中在与所述第一靶特异性区域杂交之前，所述第一桥接探针的所述第一衔接子着陆序列与所述衔接子锚定探针的所述第一桥接结合序列结合。7.根据权利要求1
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5中任一项所述的方法，其中在与所述第一靶特异性区域杂交之后，所述第一桥接探针的所述第一衔接子着陆序列与所述衔接子锚定探针的所述第一桥接结合序列结合。8.根据权利要求1
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7中任一项所述的方法，其中在与所述第二靶特异性区域杂交之前，所述第二桥接探针的所述第二衔接子着陆序列与所述衔接子锚定探针的所述第二桥接结合序列结合。9.根据权利要求1
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7中任一项所述的方法，其中在与所述第二靶特异性区域杂交之后，所述第二桥接探针的所述第二衔接子着陆序列与所述衔接子锚定探针的所述第二桥接结合序列结合。10.根据权利要求1
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9中任一项所述的方法，进一步包括将所述第一桥接探针的所述第一衔接子着陆序列与所述衔接子锚定探针的所述第一桥接结合序列杂交。11.根据权利要求1
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10中任一项所述的方法，进一步包括将所述第二桥接探针的所述第二衔接子着陆序列与所述衔接子锚定探针的所述第二桥接结合序列杂交。12.根据权利要求1
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11中任一项所述的方法，其中所述衔接子锚定探针进一步包含位于所述第一桥接结合序列和所述第二桥接结合序列之间的间隔子。13.根据权利要求1
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12中任一项所述的方法，其中所述衔接子包含分子条形码。14.根据权利要求1
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13中任一项所述的方法，其中所述衔接子锚定探针包含结合部分。15.根据权利要求14所述的方法，其中将所述结合部分附接至支持物。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述支持物是珠子。17.根据权利要求16所述的方法，其中所述珠子是链霉亲和素珠子。18.根据权利要求14
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17中任一项所述的方法，其中所述结合部分是生物素。
19.根据权利要求1
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18中任一项所述的方法，其中所述第一桥接探针包含结合部分。20.根据权利要求19所述的方法，其中将所述结合部分附接至支持物。21.根据权利要求20所述的方法，其中所述支持物是珠子。22.根据权利要求21所述的方法，其中所述珠子是链霉亲和素珠子。23.根据权利要求19
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22中任一项所述的方法，其中所述结合部分是生物素。24.根据权利要求1
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23中任一项所述的方法，其中所述模板核酸分子包含单链DNA。25.根据权利要求1
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23中任一项所述的方法，其中所述模板核酸分子包含来自生物样本的无细胞核酸。26.根据权利要求25所述的方法，其中所述无细胞核酸包含无细胞DNA。27.根据权利要求26所述的方法，其中所述无细胞DNA包含循环肿瘤DNA。28.根据权利要求1
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27中任一项所述的方法，其中所述模板核酸分子包含受损的DNA。29.一种方法，所述方法包括：将第一桥接探针的第一靶特异性区域与模板核酸分子的第一靶序列杂交，其中所述第一桥接探针的第一衔接子着陆序列与衔接子锚定探针的第一桥接结合序列结合；将第二桥接探针的第二靶特异性区域与所述模板核酸分子的第二靶序列杂交，其中所述第二桥接探针的第二衔接子着陆序列与所述衔接子锚定探针的第二桥接结合序列结合，从而生成与所述第一桥接探针和所述第二桥接探针杂交的模板核酸分子；并且在所述第一靶特异性区域的杂交和所述第二靶特异性区域的杂交之后，用甲基化测定试剂处理所述模板核酸分子。30.根据权利要求29所述的方法，其中所述甲基化测定试剂是二硫化物或修饰甲基化胞嘧啶的酶。31.根据权利要求29所述的方法，进一步包括将第三桥接探针的第三靶特异性区域与模板核酸分子的第三靶序列杂交，其中所述第三桥接探针的第三衔接子着陆序列与衔接子锚定探针的第三桥接结合序列结合。32.根据权利要求31所述的方法，进一步包括将第四桥接探针的第四靶特异性区域与模板核酸分子的第四靶序列杂交，其中所述第四桥接探针的第四衔接子着陆序列与衔接子锚定探针的第四桥接结合序列结合。33.根据权利要求29所述的方法，进一步包括在杂交所述第一桥接探针和杂交所述第二桥接探针之前，将衔接子附接至所述模板核酸分子的5'端或3'端。34.根据权利要求33所述的方法，进一步包括将衔接子引物与附接至所述模板核酸分子的3'端的衔接子杂交，所述模板核酸分子与所述第一桥接探针和所述第二桥接探针杂交；并且延伸所述衔接子引物的3'端，从而生成延伸产物。35.根据权利要求34所述的方法，进一步包括对所述延伸产物进行测序。36.根据权利要求34所述的方法，其中所述衔接子引物的杂交在用亚硫酸氢盐处理之前进行。37.根据权利要求34所述的方法，其中所述衔接子引物的杂交在用亚硫酸氢盐处理之后进行。38.根据权利要求34所述的方法，其中所述衔接子引物基于用亚硫酸氢盐处理之后的所述衔接子设计，其中所述衔接子中的非甲基化胞嘧啶在处理过程中转化为尿嘧啶。
39.根据权利要求29
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38中任一项所述的方法，其中在所述第一靶特异性区域杂交之前，所述第一桥接探针的所述第一衔接子着陆序列与所述衔接子锚定探针的所述第一桥接结合序列结合。40.根据权利要求29
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38中任一项所述的方法，其中在所述第一靶特异性区域杂交之后，所述第一桥接探针的所述第一衔接子着陆序列与所述衔接子锚定探针的所述第一桥接结合序列结合。41.根据权利要求29
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40中任一项所述的方法，其中在所述第二靶特异性区域杂交之前，所述第二桥接探针的所述第二衔接子着陆序列与所述衔接子锚定探针的所述第二桥接结合序列结合。42.根据权利要求29
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40中任一项所述的方法，其中在所述第二靶特异性区域杂交之后，所述第二桥接探针的所述第二衔接子着陆序列与所述衔接子锚定探针的所述第二桥接结合序列结合。43.根据权利要求29
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42中任一项所述的方法，进一步包括将所述第一桥接探针的所述第一衔接子着陆序列与所述衔接子锚定探针的所述第一桥接结合序列杂交。44.根据权利要求29
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43中任一项所述的方法，进一步包括将所述第二桥接探针的所述第二衔接子着陆序列与所述衔接子锚定探针的所述第二桥接...

【专利技术属性】
技术研发人员：林盛榕，包赟，王恒，格雷斯，
申请(专利权)人：艾维达生物医学公司，
类型：发明
国别省市：