本发明专利技术公开了一种具有抗重金属及解磷功能的复合微生菌剂，包括2种细菌：嗜根寡养单胞菌(Stenotrophomonas rhizophila)和假单胞菌(Pseudomonas sp.)，以及2种霉菌：草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)和日本曲霉菌(Aspergillus japonicus)。该菌剂的制备过程包括：菌种活化、种子液制备和液态复合菌剂制备制备3个步骤。本发明专利技术技术对缓解重金属对植物的毒害、促进当地植被生长具有重要意义，在重金属污染的土壤的生物修复中具有广阔的应用潜力。用潜力。用潜力。
【技术实现步骤摘要】
oxalicum)和日本曲 霉菌(Aspergillus japonicus)分别编号为P
‑
1和A
‑
1，两株霉菌草酸青霉菌和日本曲霉菌均 已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，(保藏地址是：北京 市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码：100101)，保藏号分别为CGMCC.No.7699和 CGMCC.No.7700，保藏日期为2013年6月14日，经检验均存活。
[0010]本专利技术还提供所述复合菌剂的制备方法，其步骤如下：
[0011](1)菌株活化：取本专利技术微生物4℃保存的斜面，2种细菌接种到LB固体平板培养基， 在35℃的恒箱中培养2d，2种霉菌接种到PDA固体培养基，在28℃的恒箱中培养4d，实 现菌株活化；
[0012](2)种子液制备：将步骤(1)中经斜面活化的菌种平板，2种细菌转接到200mL无菌LB 液体培养基中，pH 7.2
‑
7.4，35℃、150rpm摇床条件下培养，2种霉菌转接到400mL无菌 PD液体培养基中，自然pH，28℃、180rpm摇床条件下培养，嗜根寡养单胞菌和假单胞菌 培养12h，草酸青霉菌和日本曲霉菌培养96h，获得各菌的种子液；
[0013](3)液体发酵复合菌剂的制备：上述种子液按10％(v/v)的接种量接种至已灭菌的发酵 罐中，进行扩大发酵培养，嗜根寡养单胞菌和假单胞菌在温度35℃、振荡频率150rpm的 条件下培养24h，草酸青霉菌和日本曲霉菌在温度28℃、振荡频率170rpm的条件下培养 120h，上述菌液按体积比1∶1∶2∶2混合均匀，即得到液体发酵的复合微生物菌剂。
[0014]本专利技术具有以下有益效果：
[0015]本专利技术涉及菌株种类多，功能全面，其中2株细菌具有抗重金属、吸附并氧化重金属、 产生植物促生因子及固氮作用，1株草酸青霉菌和1株日本曲霉菌具有高效解磷并促进植 物生长作用，各菌株间没有拮抗作用且具有良好的协同作用，这种协同作用可有效的， 加速重金属污染地区养分的释放，改善土壤理化性质，修复受损生态，使植物健康生长。
[0016]将本专利技术所述复合菌剂应用于重金属污染的矿区土壤中，与不添加复合菌剂的对照 基质相比，土壤养分大大提高，植物株高、生物量及各项生理指标均得到提高。
[0017]本专利技术技术解决了重金属污染地区养分难以直接被植物利用、活性微生物种类和数 量少的问题，不仅为重金属污染矿石资源化利用提供了一条新途径，而且生产的复合菌 剂具有对环境友好，生产成本低的特点，产品还具有明显改善土壤环境质量、促进植株 生长的功能，在重金属污染地区的生物修复等方面具有广阔的应用前景。
附图说明
[0018]图1本专利技术草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)和日本曲霉菌(Aspergillus japonicus) 在Zn
2+
、Pb
2+
和Cr
3+
平板上的生长状况。
[0019]图2本专利技术草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)和日本曲霉菌(Aspergillus japonicus) 在Cd
2+
、Cu
2+
和Cr
6+
平板上的生长状况。
[0020]图3本专利技术草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)和日本曲霉菌(Aspergillus japonicus) 溶磷量。
具体实施方式
[0021]下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本专利技术，但并不是对本专利技术的限制， 仅仅作示例说明。
[0022]实施例1菌株之间拮抗作用研究
[0023]将上述2株细菌分别与2株霉菌两两划线在含有等体积的LB和PDA固体培养基上，两两划线但不相交，30℃，培养4d。两菌交叉处如形成无菌区，说明两菌之间产生了抑菌圈，两菌彼此拮抗，不能组合到一起，如果两菌间没有形成无菌区，则说明两菌不彼此拮抗，可以组合。从结果来看，各个菌株之间没有拮抗作用，不会互相干扰，影响菌种生长，因此可以混合制作为复合菌剂。
[0024]表1菌株拮抗实验结果
[0025][0026]注：“+”表示阳性，有拮抗作用；
“‑”
表示阴性，无拮抗作用
[0027]76：Stenotrophomonasrhizophila；122：Pseudomonassp.；P
‑
1：Penicilliumoxalicum；A
‑
1：Aspergillusjaponicus
[0028]实施例2两株抗锑细菌对Sb(III)的氧化能力研究
[0029]将菌株于CDM培养基中活化，转接到装有100mLCDM液体培养基中，其中含有25μM酒石酸锑钾([C8H4K2O
12
Sb2·
3(H2O)])和亚砷酸钠。30℃、150r/min振荡培养10天，用氢化物发生原子荧光光谱法(HG
‑
AFS)测定Sb(III)和Sb(V)的浓度。结果见表2。由表2可以看出，两株抗锑细菌对Sb(III)的氧化率均达到20％以上，将高毒性的Sb(III)的氧化成低毒性的Sb(V)，降低锑对菌体及环境的毒性。
[0030]表2两株抗锑细菌对Sb(III)的氧化率
[0031][0032]实施例3两株解磷真菌对重金属抗性的研究
[0033]挑取少量的解磷真菌P
‑
1和A
‑
1的菌丝，接种于含有6种重金属不同浓度的固体解磷平板上，每个实验处理至少重复3个平板，将所有平板标记并封口，置于28℃恒温箱中培养一周后，观察每个平板上2种真菌的生长状况并拍照。在液体检测溶磷量的实验中，首先分别得到2株真菌最适孢子浓度的悬浮液，吸取1mL加入到6种重金属的不同浓度的液体培养基中，每个实验处理重复3瓶，置于150rpm，28℃摇床中培养，然后在培养的第1、第5、第10和第15天分别检测每瓶培养基上清液的可溶性磷的含量。结果见图1、图2。由图1、图2可以看出，2株真菌对于重金属Pb、Cr、Cu和Cd具有非常高的抗性。
[0034]实施例4两株解磷真菌的解磷能力研究
[0035]将解磷平板中出现较大解磷圈真菌分别进行溶磷量的检测。具体操作如下：
[0036](1)真菌先接种于含有马丁培养基斜面，28℃活化48h，然后将20mL的无菌蒸馏水倒入斜面，制成真菌孢子悬浮液，再取1mL孢子悬浮液加入到装有20mL液体解磷培养基的
锥形瓶中，每种真菌重复3瓶，每天检测上清液的可溶性磷含量和pH值。同时设置 空白组，空白组也重复3瓶。
[0037](2)使用磷锑钼蓝分光光度法检测上清液中可溶性磷的含量。磷标准曲线的制作步骤 如下：A.准确称量0.2195g干燥的KH2PO4，溶于5ml浓硫酸，定容1L，该溶液中磷的 终浓度是50mg/L。B.稀释标准磷溶液为5mg/L，分别本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种具有抗重金属及解磷功能的复合微生菌剂，所属复合菌剂包括细菌和霉菌，其中细菌为嗜根寡养单胞菌(Stenotrophomonas rhizophila)和假单胞菌(Pseudomonas sp.)，霉菌为草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)和日本曲霉菌(Aspergillus japonicus)，两株霉菌保藏号分别为CGMCC.No.7699和CGMCC.No.7700，均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，所述复合微生物菌剂中各菌株由液态发酵获得。2.一种如权利要求1所述的复合菌剂制备方法，包括如下制备步骤：(1)菌株活化：取本发明微生物4℃保存的斜面，2种细菌接种到LB固体平板培养基，在35℃的恒箱中培养2d，2种霉菌接种到PDA固体培养基，在28℃的恒箱中培养4d，实现菌株活化；(2)种子液制备：将步骤(1)中经斜面活化的菌种平板，2种细菌转接到200mL无菌LB液体培养基中，pH 7.2
‑
7.4，35...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨明佳，王晓雪，孙鑫，宋奕铭，彭霞薇，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：
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