一种原位检测蛋白质与脱氧核糖核苷酸结合位置的方法技术

本发明专利技术公开了一种原位检测蛋白质与脱氧核糖核苷酸结合位置的方法，包括构建表达胞嘧啶脱氧核苷酸脱氨酶

【技术实现步骤摘要】
一种原位检测蛋白质与脱氧核糖核苷酸结合位置的方法


[0001]本专利技术属于合成生物学
，具体涉及一种原位检测蛋白质与脱氧核糖核苷酸结合位置的方法。

技术介绍

[0002]转录调节蛋白在其基因组DNA上的结合位点通常是一段比较保守的核苷酸序列，寻找目标转录因子在基因组DNA上的结合位置可以帮助研究者发现该转录因子调节哪些基因的表达。因此，蛋白质与DNA相互作用的检测方法是解析生命系统基因调控线路以及信号传导通路的一项关键技术。
[0003]目前用于检测蛋白质与DNA相互作用最常用的方法是染色质免疫共沉淀
‑
测序技术，该方法在细菌中的具体做法是首先过表达融合了标签序列的转录因子，进而对转录因子结合的DNA片段进行打断、富集和分离，最后通过测序的方法获得这些DNA的序列。另外，还有一些人开发出Calling
‑
cards方法，将目标转录因子与逆转录转座子引导蛋白Sir4融合，引导转座子在基因组上转录因子结合区域进行转座插入，再通过酶切、环化和测序的方法来确定转座子插入的位置，进而确定目标转录因子的结合位点。Calling
‑
cards方法目前使用的人较少。
[0004]现有的染色质免疫共沉淀
‑
测序技术的缺点是：1)操作时间较长，劳动量大；2)步骤较多，一些实验中的微小失误可能慢慢积累，导致最终得到的数据结果不能满意，也因为这个原因，实验发生问题之后的排查也很困难；3)实验过程中需要注意的技术细节较多，比如蛋白质如何固定、DNA如何纯化、DNA打断的超声条件等都会大大影响最终结果，对于很多实验人员来说难以在短时间内掌握技术要领，因此不具备很好的推广性。
[0005]因此，寻找一种快速检测蛋白质与DNA相互作用的方法具有重要意义。

技术实现思路

[0006]为了解决现有技术中的不足，本专利技术的目的在于提供一种原位检测蛋白质与脱氧核糖核苷酸结合位置的方法。本专利技术通过理论推导以及实验方法的优化成熟，实现在基因组上对目标蛋白结合位点的全局扫描，并利用生物信息学方法预测蛋白质结合脱氧核糖核苷酸(以下都简写为DNA)的保守核苷酸序列，能够在微生物细胞内部实现对目标蛋白质与DNA相互作用检测。具体技术方案如下：
[0007]本专利技术第一方面提供一种原位检测蛋白质与脱氧核糖核苷酸结合位置的方法，包括：
[0008]1)构建表达胞嘧啶脱氧核苷酸脱氨酶
‑
目标蛋白融合蛋白的目标菌株，以及表达目标蛋白的对照菌株；
[0009]所述目标菌株和对照菌株不含尿嘧啶DNA糖苷酶基因；
[0010]2)诱导目标菌株和对照菌株的蛋白表达后，提取目标菌株和对照菌株的基因组DNA；
[0011]3)对目标菌株和对照菌株的基因组DNA进行高通量测序，分析获得目标菌株和对照菌株的基因组DNA的点突变，剔除目标菌株和对照菌株共有的点突变后，从目标菌株的余下点突变中筛选处于非编码区的点突变，即为目标蛋白结合位点。
[0012]进一步地，步骤3)中目标菌株和对照菌株的基因组DNA各设置n组进行高通量测序，进一步获得目标蛋白结合位点，具体包括：对n组目标菌株和n组对照菌株的基因组DNA进行高通量测序，分析获得目标菌株和对照菌株的基因组DNA的点突变，剔除目标菌株和对照菌株共有的点突变后，从目标菌株的余下点突变中筛选n组目标菌株的共有点突变，筛选处于于非编码区的共有点突变，即为目标蛋白结合位点；
[0013]所述2≤n≤5。
[0014]进一步地，所述表达胞嘧啶脱氧核苷酸脱氨酶
‑
目标蛋白融合蛋白的目标菌株的构建方法包括：构建胞嘧啶脱氧核苷酸脱氨酶
‑
目标蛋白融合蛋白表达载体，然后将该融合蛋白表达载体导入不含尿嘧啶DNA糖苷酶基因的菌株中；
[0015]所述达目标蛋白的对照菌株的构建方法包括：构建目标蛋白表达载体，然后将该目标蛋白表达载体导入不含尿嘧啶DNA糖苷酶基因的菌株中。
[0016]进一步地，所述胞嘧啶脱氧核苷酸脱氨酶
‑
目标蛋白融合蛋白表达载体中，胞嘧啶脱氧核苷酸脱氨酶位于融合蛋白的氮端，目标蛋白位于融合蛋白的碳端，胞嘧啶脱氧核苷酸脱氨酶和目标蛋白用8个甘氨酸连接。
[0017]进一步地，所述诱导目标菌株和对照菌株的蛋白表达，步骤包括：复苏菌株，挑取克隆菌斑，使用LB培养基加诱导剂37℃摇菌6
‑
20小时；
[0018]优选地，所述诱导剂为阿拉伯糖；
[0019]优选地，所述LB培养基的配方为：氯化钠10g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L。
[0020]进一步地，所述目标蛋白为转录因子。
[0021]进一步地，所述原位检测蛋白质与脱氧核糖核苷酸结合位置的方法还包括计算目标蛋白结合的保守DNA序列，具体步骤包括：
[0022]以步骤3)获得的目标蛋白结合位点为中心，在基因组DNA的上游和下游各延长m个碱基对，获得包含目标蛋白结合位点的DNA片段序列；所述10≤m≤200；
[0023]将包含目标蛋白结合位点的DNA片段序列存入文本文档，利用生物信息学工具MEME Suite计算出目标蛋白结合的保守DNA序列。
[0024]本专利技术第二方面提供一种启动子转录表达的蛋白质胞内浓度的预测方法，包括：基于本专利技术原位检测蛋白质与脱氧核糖核苷酸结合位置的方法对转录因子靶向启动子进行突变，并根据下述公式预测启动子转录表达的蛋白质胞内浓度；
[0025]x＝1
‑
exp(
‑
K5·
[Protein]·
t)
[0026]其中，
[0027]x表示转录因子靶向启动子上被突变DNA所占比例；
[0028][Protein]表示启动子转录表达的蛋白质胞内浓度；
[0029]t表示突变过程发生的总时间；
[0030]K5表示平衡常数，K5表示如下：
[0031][0032]k
TIC1
、k
TIC2
为常数，k
translation
为翻译率，γ
mRNA
为mRNA分解率，γ
Protein
为蛋白质降解率。
[0033]进一步地，所述转录因子靶向启动子上被突变DNA所占比例x表示如下：
[0034]x＝1
‑
exp(
‑
k
m
·
t)
[0035]其中，
[0036]k
m
表示转录因子结合位点的突变率；
[0037]t表示突变过程发生的总时间。
[0038]进一步地，所述转录因子靶向启动子上被突变DNA所占比例x表示如下：
[0039]x＝1
‑
exp(
‑
K3·
θ
·
t)
[0本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种原位检测蛋白质与脱氧核糖核苷酸结合位置的方法，其特征在于，包括：1)构建表达胞嘧啶脱氧核苷酸脱氨酶
‑
目标蛋白融合蛋白的目标菌株，以及表达目标蛋白的对照菌株；所述目标菌株和对照菌株不含尿嘧啶DNA糖苷酶基因；2)诱导目标菌株和对照菌株的蛋白表达后，提取目标菌株和对照菌株的基因组DNA；3)对目标菌株和对照菌株的基因组DNA进行高通量测序，分析获得目标菌株和对照菌株的基因组DNA的点突变，剔除目标菌株和对照菌株共有的点突变后，从目标菌株的余下点突变中筛选处于非编码区的点突变，即为目标蛋白结合位点。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中目标菌株和对照菌株的基因组DNA各设置n组进行高通量测序，进一步获得目标蛋白结合位点，具体包括：对n组目标菌株和n组对照菌株的基因组DNA进行高通量测序，分析获得目标菌株和对照菌株的基因组DNA的点突变，剔除目标菌株和对照菌株共有的点突变后，从目标菌株的余下点突变中筛选n组目标菌株的共有点突变，筛选处于于非编码区的共有点突变，即为目标蛋白结合位点；所述2≤n≤5。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表达胞嘧啶脱氧核苷酸脱氨酶
‑
目标蛋白融合蛋白的目标菌株的构建方法包括：构建胞嘧啶脱氧核苷酸脱氨酶
‑
目标蛋白融合蛋白表达载体，然后将该融合蛋白表达载体导入不含尿嘧啶DNA糖苷酶基因的菌株中；所述达目标蛋白的对照菌株的构建方法包括：构建目标蛋白表达载体，然后将该目标蛋白表达载体导入不含尿嘧啶DNA糖苷酶基因的菌株中。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述胞嘧啶脱氧核苷酸脱氨酶
‑
目标蛋白融合蛋白表达载体中，胞嘧啶脱氧核苷酸脱氨酶位于融合蛋白的氮端，目标蛋白位于融合蛋白的碳端，胞嘧啶脱氧核苷酸脱氨酶和目标蛋白用8个甘氨酸连接。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱导目标菌株和对照菌株的蛋白表达，步骤包括：复苏菌株，挑取克隆菌斑，使用LB培养基加诱导剂37℃摇菌6
‑
20小时；优选地，所述诱导剂为阿拉伯糖；优选地，所述LB培养基的配方为：氯化钠10g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标蛋白为转录因子。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括计算目标蛋白结合的保守DNA序列，具体步骤包括：以步骤3)获得的目标蛋白结合位点为中心，在基因组DNA的上游和下游各延长m个碱基对，获得包含目标蛋白结合位点的DNA片段序列；所述10≤m≤200；将包含目标蛋白结合位点的DNA片段序列存入...

【专利技术属性】
技术研发人员：倪磊，金帆，李飞旋，
申请(专利权)人：中国科学院深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：