一种人源组织及细胞中甘油磷脂代谢定量检测试剂盒及其检测方法和应用技术

本发明专利技术提供一种人源组织及细胞中甘油磷脂代谢定量检测试剂盒，所述试剂盒包括至少一个混合标准测试品，所述混合标准测试品中包括28种甘油磷脂代谢物的标准品和36种甘油磷脂代谢酶的特征肽段标准品。本发明专利技术进一步提供试剂盒的用途及对人源组织及细胞中甘油磷脂的检测方法。本发明专利技术提供的一种人源组织及细胞中甘油磷脂代谢定量检测试剂盒及其检测方法和应用，能够同时准确定量检测人源性组织或细胞样本中28种功能性磷脂以及36种关键的磷脂代谢酶，灵敏度高，特异性强，所需样本量少，检测时间短，提高了方法的灵敏度、精密度、效率和检测通量，成本低廉，且试剂盒有效期长，避免了资源浪费。源浪费。

【技术实现步骤摘要】
一种人源组织及细胞中甘油磷脂代谢定量检测试剂盒及其检测方法和应用


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种人源组织及细胞中甘油磷脂代谢定量检测试剂盒及其检测方法和应用。

技术介绍

[0002]甘油磷脂是动物体内一类非常重要的脂质，它们既是细胞膜的基本组成成分，也是能量供应、信号传导的重要参与分子，因此甘油磷脂代谢异常跟诸多疾病(如：心血管疾病和癌症等)密切相关。甘油磷脂根据极性头部取代基的不同，一共可以分为6个亚类，即：磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)和心磷脂(CL)。每一亚类甘油磷脂根据甘油羟基sn
‑
1和sn
‑
2位上连接的脂肪酸的顺序不同、酯键的形式不同、脂肪酸C原子数目不同、脂肪酸不饱和程度和不饱和键的位置不同，又由数千种脂质分子组成。因此，动物体内甘油磷脂分子是非常复杂的，有数万种之多，对所有的甘油磷脂分子进行准确的定性定量是一件非常困难的事情。
[0003]然而，随着功能脂质组学的发展，大量的研究已经可以将一些特异性的脂质分子与特异性生理功能或病理机制相关联。这部分功能脂质数量不多，但发挥非常重要的生物学功能。因此，定量检测这部分功能性的甘油磷脂具有重要意义。机体中代谢物的水平与代谢物的合成、转运和代谢相关，若要了解疾病状态下机体的代谢状态，除了定量检测代谢物的浓度外，还需要检测相关代谢酶(合成酶、转运酶和代谢酶)的表达水平。甘油磷脂的检测主要是基于液相色谱质谱联用(LC
‑<br/>MS)平台来进行，而相关代谢酶的检测主要是通过酶联免疫法(ELISA)、蛋白印迹法(Western Blot)或免疫组化法来分析。代谢物和代谢酶的检测需要借助不同的平台，不同的样本以及不同的前处理方法来完成，非常的耗时费力，且无法实现高通量检测。目前，市面上尚无基于LC
‑
MS平台的磷脂代谢物和代谢酶联合检测的试剂盒。

技术实现思路

[0004]鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种人源组织及细胞中甘油磷脂代谢定量检测试剂盒及其检测方法和应用，基于LC
‑
MS特别是UPLC
‑
MS/MS分析平台，用于同时准确定量检测人源性组织/细胞中甘油磷脂及其相关代谢酶。
[0005]为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术第一方面提供一种人源组织及细胞中甘油磷脂代谢定量检测试剂盒，所述试剂盒包括至少一个混合标准测试品，所述混合标准测试品中包括28种甘油磷脂代谢物的标准品中的一种或多种，和/或36种甘油磷脂代谢酶的特征肽段标准品中的一种或多种，所述28种甘油磷脂代谢物和36种甘油磷脂代谢酶分别如下表1所示。
[0006]本专利技术第二方面提供上述试剂盒在定量检测人源组织及细胞中甘油磷脂中的用途。
[0007]本专利技术第三方面提供一种对人源组织及细胞中甘油磷脂的检测方法，采用上述试剂盒，包括以下步骤：
[0008]1)制备待测样品：将样本采用有机试剂蛋白沉淀法通过提取剂1提取分别获取第一上清液和蛋白沉淀；将蛋白沉淀用复溶剂1复溶、酶解、除盐、干燥后，采用复溶剂2复溶，取上清液获得多肽溶液；将第一上清液采用水和提取剂2进行液液萃取法萃取磷脂后挥干，采用复溶剂3复溶，取上清液获得磷脂溶液；再将多肽溶液和磷脂溶液混合，获得待测样品；
[0009]2)制备标准测试品：将多种甘油磷脂代谢酶的特征肽段标准品加入甲醇超声溶解获得多肽标准储备液，将多种甘油磷脂代谢物的标准品加入甲醇与氯仿的混合溶液超声溶解获得磷脂标准储备液，再取多肽标准储备液和磷脂标准储备液加入水、甲醇、氯仿的混合溶液超声溶解，获得标准测试品；
[0010]3)仪器分析：采用液相色谱质谱联用法分别测定步骤1)中的待测样品和步骤2)中的标准测试品，根据保留时间和母
‑
子离子对信息指认目标分析物，再根据目标分析物的选择离子对色谱峰面积通过标准曲线法进行定量，确定待测样品中各种甘油磷脂代谢物及甘油磷脂代谢酶的含量。
[0011]如上所述，本专利技术提供的一种人源组织及细胞中甘油磷脂代谢定量检测试剂盒及其检测方法和应用，通过基于LC
‑
MS特别是UPLC
‑
MS/MS分析平台的试剂盒，能够同时准确定量检测人源性组织或细胞样本中28种功能性磷脂以及36种关键的磷脂代谢酶，灵敏度高，特异性强，且对于有一定质谱操作经验的工作者而言，上手快，通过阅读说明书即可操作。该种试剂盒所需样本量少，优化了前处理和检测方法，检测时间短，提高了方法的灵敏度、精密度、效率和检测通量，成本低廉，且试剂盒有效期长，避免了资源浪费，可以在单个人源性组织样本中实现甘油磷脂和相关代谢酶的高通量定量分析，为相关疾病诊断标志物筛选和药物靶标挖掘打下基础。
附图说明
[0012]图1显示为本专利技术中不同提取方案的回收率考察图。
[0013]图2显示为本专利技术中目标物的LC
‑
MS/MS的提取离子图。
具体实施方式
[0014]本专利技术第一方面提供一种人源组织及细胞中甘油磷脂代谢定量检测试剂盒，所述试剂盒包括至少一个混合标准测试品，所述混合标准测试品中包括28种甘油磷脂代谢物的标准品中的一种或多种，和/或36种甘油磷脂代谢酶的特征肽段标准品中的一种或多种，所述28种甘油磷脂代谢物和36种甘油磷脂代谢酶分别如下表1所示。
[0015]表1
[0016][0017][0018][0019]在上述试剂盒中，不同所述混合标准测试品中28种甘油磷脂代谢物的标准品和36种甘油磷脂代谢酶的特征肽段标准品的相应浓度不同。
[0020]在上述试剂盒中，同一混合标准测试品中28种甘油磷脂代谢物的标准品和36种甘油磷脂代谢酶的特征肽段标准品的浓度相同。
[0021]在上述试剂盒中，所述混合标准测试品的个数为8
‑
10个。
[0022]在一种实施方式中，所述混合标准测试品的个数为9个，9个所述混合标准测试品分别用S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9表示，所述S1～S9中各种甘油磷脂代谢物的标准品及甘油磷脂代谢酶的特征肽段标准品的浓度按浓度梯度由小至大依次排序。
[0023]在上述试剂盒中，所述混合标准测试品中28种甘油磷脂代谢物的标准品和36种甘油磷脂代谢酶的特征肽段标准品复溶后的浓度范围均为0.005～110.00ng/mL，优选为0.01～100.00ng/mL。
[0024]在一种实施方式中，所述混合标准测试品复溶采用的溶剂为水、甲醇、氯仿的混合溶液。
[0025]具体来说，所述水、甲醇、氯仿的混合溶液中，所述水、甲醇、氯仿的体积之比(V/V/V)为1:3～5:1，优选为1:4:1。
[0026]所述混合标准测试品为含有28种甘油磷脂代谢物的标准品和36种甘油磷脂代谢酶的特征肽段标准品的混合溶液挥干后得到的干粉。
[0027本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括至少一个混合标准测试品，所述混合标准测试品中包括28种甘油磷脂代谢物的标准品中的一种或多种，和/或36种甘油磷脂代谢酶的特征肽段标准品中的一种或多种，所述28种甘油磷脂代谢物分别为：棕榈酰溶血磷脂酸、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、1
‑
硬脂酰2
‑
油酰基磷脂酰丝氨酸、硬脂酰溶血磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰肌醇、二硬脂酰磷脂酰肌醇、1
‑
棕榈酰2
‑
油酰基磷脂酰肌醇、1
‑
硬脂酰2
‑
花生四烯酰基磷脂酰肌醇、硬脂酰溶血磷脂酰肌醇、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、1
‑
棕榈酰2
‑
油酰基磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二十烷酰溶血磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、1
‑
棕榈酰2
‑
油酰基磷脂酰胆碱、1
‑
棕榈酰2
‑
花生四烯酰基磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、1
‑
硬脂酰2
‑
油酰基磷脂酰胆碱、1
‑
硬脂酰2
‑
二十二碳六烯基磷脂酰胆碱、棕榈酰溶血磷脂酰胆碱、油酰溶血磷脂酰胆碱、硬脂酰溶血磷脂酰胆碱、棕榈酰溶血磷脂酰乙醇胺、硬脂酰溶血磷脂酰乙醇胺、1
‑
棕榈酰2
‑
硬脂酰基磷脂酰胆碱；所述36种甘油磷脂代谢酶分别为：烷基二羟丙酮磷酸合酶、胞质酰基辅酶A硫酯水解酶、乙酰辅酶A羧化酶、酰基载体蛋白、CDP
‑
二酰甘油
‑
肌醇
‑3‑
磷脂酰转移酶、1
‑
酰基甘油
‑3‑
磷脂酰基转移酶2、二羟丙酮磷酸酰基转移酶、丝氨酸棕榈酰基转移酶2、二酰基甘油O
‑
酰基转移酶1、三磷酸腺苷结合盒转运体A8、三磷酸腺苷结合盒转运体A1、磷脂酸胞苷酰基转移酶2、磷脂酰胆碱
‑
固醇酰基转移酶、3
‑
磷酸甘油脱氢酶1、肉碱O
‑
棕榈酰转移酶2、乙酰辅酶A乙酰转移酶、3
‑
磷酸甘油脱氢酶2、磷脂酰丝氨酸合成酶、脂肪酸合成酶、磷酸胆碱胞苷酰基转移酶、肉碱O
‑
棕榈酰转移酶1、CDP
‑
二酰甘油
‑
甘油
‑3‑
磷酸
‑
3磷脂酰转移酶、丙二酸辅酶A连接酶、溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3、溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶2、三磷酸腺苷结合盒转运体A6、溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶1、磷酸胆碱转移酶1、酰基辅酶A：溶血磷脂酰甘油酰基转移酶、磷脂乙醇胺胞苷酰基转移酶、1
‑
酰基甘油
‑3‑
磷脂酰基转移酶1、乙酰辅酶A乙酰基转移酶、甘油3磷酸酰基转移酶1、1
‑
酰基甘油
‑3‑
磷脂酰基转移酶3、1
‑
酰基甘油
‑3‑
磷脂酰基转移酶5、胆碱
‑
乙醇胺磷酸转移酶。2.根据权利要求1所述的一种试剂盒，其特征在于，所述混合标准测试品中28种甘油磷脂代谢物的标准品和36种甘油磷脂代谢酶的特征肽段标准品复溶后的浓度范围均为0.005～110.00ng/mL；所述混合标准测试品复溶采用的溶剂为水、甲醇、氯仿的混合溶液。3.根据权利要求1所述的一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括有提取剂1、提取剂2、复溶剂1、复溶剂2、复溶剂3，所述提取剂1为甲醇、丙酮、甲酸的混合溶液，所述提取剂2为2,6
‑
二叔丁基
‑4‑
甲基苯酚的氯仿溶液，所述复溶剂1为盐酸胍、碳酸氢铵的混合水溶液，所述复溶剂2为水、甲醇、甲酸的混合溶液，所述复溶剂3为甲醇、氯仿、2,6
‑
二叔丁基
‑4‑
甲基苯酚的混合溶液。4.根据权利要求1所述的一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括有至少一个混合质控品，所述混合质控品中包括与混合标准测试品相同的各种甘油磷脂代谢物的标准品及甘油磷脂代谢酶的特征肽段标准品。5.根据权利要求1
‑
4任一所述的试剂盒在定量检测人源组织及细胞中甘油磷脂中的用途。6.一种对人源组织及细胞中甘油磷脂的检测方法，采用根据权利要求1
‑
4任一所述的
试剂盒，包括以下步骤：1)制备待测样品：将样本采用有机试剂蛋白沉淀法通过提取剂1提取分别获取第一上清液和蛋白沉淀；将蛋白沉淀用复溶剂1复溶、酶解、除盐、干燥后，采用复溶剂2复溶，取上清液获得多肽溶液；将第一上...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭章晓，沈珈西，宁慧，舒烈波，张彦军，陈敏，方后琴，胡哲，
申请(专利权)人：上海鹿明生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：