本发明专利技术提供了一种含角蛋白酶突变体和胆汁酸的饲料添加剂及其应用。本发明专利技术使用饱和突变方法对Bacillus licheniformis来源的角蛋白酶基因进行突变，获得角蛋白酶突变体KS01、KS02、KS03、KS04，相比于原始角蛋白酶，突变体最适反应温度由55℃，分别降低到38℃、45℃、46℃、50℃，并且突变体KS01在25℃至35℃反应条件下，剩余酶活力在65%以上。本发明专利技术还利用含突变体的工程菌经发酵、过滤干燥制得的酶制剂与胆汁酸进行复配，不仅其具有很好的酶解豆粕抗原蛋白的效果，而且用于禽畜养殖中，能够明显起到防腹泻作用，并保护动物的肠胃，具有良好的工业价值和市场应用前景。的工业价值和市场应用前景。的工业价值和市场应用前景。
【技术实现步骤摘要】
一种含角蛋白酶突变体和胆汁酸的饲料添加剂及其应用
[0001]本专利技术属于饲料添加剂领域，具体涉及一种含角蛋白酶突变体和胆汁酸的饲料添加剂及其应用。
技术介绍
[0002]角蛋白酶是一种能够降解角蛋白类底物(例如角质，皮屑，羽毛等)的特异性角蛋白酶，由真菌、放线菌和细菌等多种微生物以角蛋白为单一碳源生长时产生。角蛋白酶作为一种底物专一性较宽泛，水解催化能力强的蛋白酶，广泛地运用于日化行业、畜牧行业、饲料行业、制革行业、医药行业中，具有巨大的研究与应用价值。角蛋白中其粗蛋白含量在80％以上，各种氨基酸总量在70％以上，动物必需氨基酸种类齐全，同时含有较多大量元素、微量元素和未知生长因子，是一种良好的、可替代或部分替代鱼粉的饲料蛋白以及肥料来源，对它的开发利用具有重要的应用前景。目前，野生角蛋白酶大多属于高温碱性蛋白酶，其最适反应温度一般为60℃左右，在20℃
‑
40℃条件下的酶活或者催化活性一般不高。
[0003]易错PCR技术是采用DNA聚合酶在进行PCR反应扩增目的片段的同时，通过调整反应条件，增加基因突变频率，从而以一定的频率向目的基因中随机引入突变，构建突变体文库，再通过高通量方式筛选需要的正向突变体。易错PCR技术是蛋白质分子改造中的重要手段。
技术实现思路
[0004]本专利技术提供了一种含角蛋白酶突变体和胆汁酸的饲料添加剂及其应用。本专利技术通过随机突变筛选得到几种在低温条件下酶活提高的突变体：KS01、KS02、KS03、KS04，并将其与胆汁酸混合制成饲料添加剂，有效的降低禽畜动物的腹泻情况，提高其肠道功能。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：本专利技术提供了一种角蛋白酶突变体，所述角蛋白酶突变体的氨基酸序列具有如下之一所述的氨基酸序列：（1）如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；（2）如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；（3）如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；（4）如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。
[0006]进一步的，所述角蛋白酶突变体具体为由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的角蛋白酶的第340位的丝氨酸变为缬氨酸获得的角蛋白酶突变体KS01；由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的角蛋白酶的第340位丝氨酸变为谷氨酸获得的角蛋白酶突变体KS02；由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的角蛋白酶的第340位的丝氨酸变为亮氨酸获得的角蛋白酶突变体KS03；由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的角蛋白酶的第340位的丝氨酸变为苯丙氨酸获得的角蛋白酶突变体KS04。
[0007]本专利技术还提供了所述的角蛋白酶突变体的编码基因，所述编码基因具有如下之一
所述的核苷酸序列：（1）如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列；（2）如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列；（3）如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列；（4）如SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列。
[0008]本专利技术还提供了包含所述的角蛋白酶突变体的编码基因的重组表达载体。
[0009]本专利技术还提供了包含所述的角蛋白酶突变体的编码基因的重组工程菌。
[0010]进一步的，所述重组工程菌为枯草芽胞杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽胞杆菌。
[0011]本专利技术还提供了一种饲料添加剂，所述饲料添加剂中同时包含角蛋白酶突变体和胆汁酸。
[0012]进一步的，所述饲料添加剂是由含角蛋白酶突变体的重组工程菌经发酵、过滤干燥制得的酶制剂与胆汁酸以1:1~5的质量体积比混合而成的。
[0013]本专利技术还提供了所述的角蛋白酶突变体或者所述的饲料添加剂在用于制备促进动物生长以及降低动物腹泻的饲料中的应用。
[0014]进一步的，所述角蛋白酶突变体或饲料添加剂的用量为100 g/t动物饲料~500 g/t动物饲料。
[0015]与现有技术相比，本专利技术的优点和技术效果是：本专利技术以Bacillus licheniformis来源的角蛋白酶基因为基础，筛选得到了包含S340V、S340E、S340L和S340F的突变体KS01、KS02、KS03和KS04，其相比于原始角蛋白酶，突变体最适反应温度由55℃，分别降低到38℃、45℃、46℃、50℃，并且突变体KS01在25℃至35℃反应条件下，剩余酶活力在65%以上，使其在洗涤、制革、饲料等领域具有良好的市场应用潜力。
[0016]本专利技术还利用含突变体的工程菌经发酵、过滤干燥制得的酶制剂与胆汁酸进行复配，不仅其具有很好的酶解豆粕抗原蛋白的效果，而且用于禽畜养殖中，能够明显起到防腹泻作用，并保护动物的肠胃。
附图说明
[0017]图1是所述角蛋白酶基因扩增电泳结果图。
[0018]图2是所述角蛋白酶突变体筛选过程图。
[0019]图3是所述角蛋白酶突变体酶活力和最适反应温度分析。
[0020]图4是所述角蛋白酶突变体KL01在15L发酵罐中的发酵数据。
[0021]图5是所述角蛋白酶突变体发酵液对羽毛蛋白的降解效果。
[0022]图6是角蛋白酶体外酶解豆粕抗原蛋白的胶图，其中编号1是豆粕未做处理，编号2
‑
5分别是加入200U/mL角蛋白酶后，处理2h、4h、8h、16h。
具体实施方式
[0023]为了便于理解本专利技术，以下将结合附图及实施例对本文专利技术做更全面、详细地说明，但本专利技术的保护范围并不限于以下具体实施例。
[0024]以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，可以参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。具体实施例中使用的试剂和生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。
[0025]1、菌株和载体枯草芽胞杆菌WB600，质粒pWB980，大肠杆菌BL21，质粒pET
‑
21a(+)购自Invitrogen公司。
[0026]2、试剂与培养基质粒提取试剂盒，片段纯化回收试剂盒，限制性内切酶，蛋白Marker：Blue Plus II Protein Marker (14
‑
120 kDa)等购自南京诺唯赞股份有限公司；氨苄青霉素购自生工生物工程(上海)股份有限公司；GeneMorph II随机突变PCR试剂盒购自Stratagene公司。
[0027]LB培养基配方：1％胰蛋白胨，0 .5％酵母提取物，1％NaCl。
[0028]发酵培养基配方：豆粕3.5
‑
10%、棉籽粕5
‑
10%、玉米粉2
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6%、PPG
‑
20000 0.5
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1.0%、蛋白酶0.5
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1.0%、淀粉酶0.5
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1.0%、磷酸氢二钠0.2
‑
0.5%，以质量比计。
[0029]3、酶活力测定：参照《G本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种角蛋白酶突变体，其特征在于，所述角蛋白酶突变体的氨基酸序列具有如下之一所述的氨基酸序列：（1）如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；（2）如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；（3）如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；（4）如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的角蛋白酶突变体，其特征在于，所述角蛋白酶突变体具体为由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的角蛋白酶的第340位的丝氨酸变为缬氨酸获得的角蛋白酶突变体KS01；由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的角蛋白酶的第340位丝氨酸变为谷氨酸获得的角蛋白酶突变体KS02；由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的角蛋白酶的第340位的丝氨酸变为亮氨酸获得的角蛋白酶突变体KS03；由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的角蛋白酶的第340位的丝氨酸变为苯丙氨酸获得的角蛋白酶突变体KS04。3.权利要求1所述的角蛋白酶突变体的编码基因，其特征在于，所述编码基...
【专利技术属性】
技术研发人员：娄倩倩，曹爱智，张西雷，徐志敏，
申请(专利权)人：山东龙昌动物保健品有限公司，
类型：发明
国别省市：
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