一种新冠病毒RBD蛋白的制备方法及其在疫苗中的应用技术

本发明专利技术涉及疫苗领域，尤其涉及一种新冠病毒RBD蛋白的制备方法及其在疫苗中的应用。本发明专利技术通过优化RBD蛋白的密码子，使得RBD蛋白在Bac

【技术实现步骤摘要】
一种新冠病毒RBD蛋白的制备方法及其在疫苗中的应用


[0001]本专利技术涉及疫苗领域，尤其涉及一种新冠病毒RBD蛋白的制备方法及其在疫苗中的应用。

技术介绍

[0002]新型冠状病毒是继严重急性呼吸系统综合症冠状病毒和中东呼吸综合症冠状病毒后又一能引发严重急性呼吸道疾病且具有严重传染性的病毒，其所引发的新型冠状病毒肺炎尚无特效疗法。当前国际病毒分类委员会将新型冠状病毒的病毒名为SARS
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2，其引起的疾病则被世界卫生组织命名为COVID
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19。
[0003]目前，研发人员解析了SARS
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CoV
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2病毒的关键组成蛋白的三维结构、揭示了新冠病毒的入侵细胞的机理。SARS
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CoV
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2通过的S蛋白与ACE2受体(血管紧张素转换酶2)结合，介导病毒进入宿主细胞。在感染过程中，S蛋白被宿主蛋白酶切割成N端的S1亚基和C端的S2亚基，并且病毒从融合前状态转变为融合后状态。S1亚基和S2亚基都由胞外结构域(ECD)和单个跨膜螺旋组成，其中S1亚基主要负责与宿主细胞受体结合，S2亚基主要负责和细胞膜融合。S1亚基又包括N端结构域(NTD)和受体结合结构域(RBD)，对决定组织嗜性和宿主范围至关重要。
[0004]RBD蛋白在SARS
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2病毒入侵细胞中发挥着重要的功能，同时，RBD蛋白也常被用作抗原用于疫苗制备。如目前已批准上市人用新冠病毒疫苗—智克威得，此疫苗为安徽智飞生物研发，其中RBD蛋白质的氨基酸序为“RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNF”,理论分子量为25.1KDa。
[0005]RBD蛋白作为抗原可用于预防新型冠状病毒的感染，但是其生产工艺复杂，产率低，因而成本较高。需要进一步优化RBD蛋白的生产制备工艺，简化工艺以降低成本的同时保证产品质量。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供一种新冠病毒RBD蛋白的制备方法及其在疫苗中的应用
[0007]本专利技术提供了一种编码RBD蛋白的核酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0008]所述核酸为基于RBD蛋白的氨基酸序列和表达宿主的密码子偏好性优化所得的最适宜RBD蛋白表达的基因序列；在本专利技术的实施例里，所述表达宿主为SF9细胞系。密码子优化后RBD蛋白的表达量明显提升，相对于野生型编码序列，密码子优化后RBD蛋白产率50mg/L提升至200mg/L。
[0009]本专利技术提供的编码所述RBD蛋白的核酸中编码RBD蛋白部分的核酸如SEQ ID NO:2所示。本专利技术在SEQ ID NO:2所示核酸序列的5
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端添加编码GP64分泌信号肽的片段以提高
可溶性蛋白的表达量，在表达后信号肽被自动切除，不影响RBD蛋白的序列。本专利技术中，编码GP64信号肽的核酸序列为atggttagtgctatcgtactttatgtg ctgcttgccgctgccgcgcactcagctttcgct。
[0010]进一步地，本专利技术提供了一种载体，其包括骨架载体和所述的核酸。
[0011]本专利技术所述的载体为用于保藏或扩增的质粒载体，或者为用于构建或包装病毒的穿梭质粒。所述病毒选自腺病毒、慢病毒或杆状病毒。本专利技术实施例中，以杆状病毒为载体侵染昆虫细胞从而实现蛋白的表达。一些实施例中，所述骨架载体包括pFastbac质粒或杆状病毒穿梭质粒。
[0012]更进一步地，本专利技术还提供了转化了所述的载体的宿主，所述宿主包括昆虫细胞或大肠杆菌。
[0013]一些实施例中，转化载体的骨架为pFastbac质粒，宿主为大肠杆菌。一些具体实施例中，以DH10 Bac为骨架载体实现杆状病毒的包装。
[0014]一些实施例中，转化载体的骨架为杆状病毒穿梭质粒，宿主为昆虫细胞。一些具体实施例中，用sf9细胞作为蛋白表达的宿主细胞。
[0015]本专利技术还提供了一种用于Bac
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Bac表达系统的重组杆状病毒，所述病毒的基因组中包括本专利技术所述的核酸。
[0016]本专利技术中，所述重组杆状病毒的构建方法包括利用Bac
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Bac表达系统将目的基因构建到杆状病毒的穿梭质粒，再将重组穿梭质粒导入细胞在细胞中组装成重组杆状病毒。
[0017]本专利技术使用病毒
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昆虫细胞系统表达目的RBD蛋白。具体地，将目的基因(所述编码RBD蛋白的核酸)与pFastbac质粒相连得到目的基因供体质粒，将所述质粒转化胞内含有杆状病毒穿梭质粒Bacmid的大肠杆菌DH10 Bac。转化进入菌株的pFastbac
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目的基因质粒与胞内的杆状病毒穿梭质粒发生重组，产生包含目的基因的杆状病毒的穿梭质粒。将所得的重组穿梭质粒侵染昆虫细胞，可以制备重组杆状病毒。所述重组杆状病毒可用于表达RBD蛋白。
[0018]本专利技术提供了所述融合蛋白的制备方法，包括：用所述的重组杆状病毒在昆虫细胞中表达目的蛋白、从所述昆虫细胞的培养上清液中纯化目的蛋白。
[0019]所述纯化目的蛋白的步骤包括超滤和离子交换层析；所述离子交换层析包括：使用阳离子交换柱富集目的蛋白、梯度盐浓度的盐溶液洗脱分离目的蛋白。
[0020]一些具体的实施例中，选用GE的SP柱对目的蛋白的表达上清液进行离子交换层析。洗脱条件为：选用pH8.0磷酸盐缓冲液为洗脱低盐，选用pH8.0磷酸盐、1M氯化钠的溶液为洗脱高盐，设置洗脱梯度为：70mL洗脱体积内,洗脱高盐的比例从0％(V/V)线性递增到50％(V/V)。
[0021]所述超滤能去除细胞上清液中的许多杂质，缩小蛋白液的体积，增加蛋白的浓度和纯度，并且能起到换液的作用。离子交换层析能根据蛋白在特定pH值溶液中所带的电性，分离获得高纯度的目的蛋白。
[0022]本专利技术提供了所述的核酸、所述的载体、所述的宿主、所述的病毒和/或所述方法制备获得的蛋白在制备防治新冠肺炎的疫苗中的应用。
[0023]本专利技术提供了一种新冠肺炎疫苗，其原料包括所述的核酸、所述的载体、所述的宿
主、所述的病毒和/或所述方法制备获得的融合蛋白。
[0024]本专利技术还提供了治疗和/或预防新冠肺炎的方法，其为给予本专利技术所述的疫苗。
[0025]本专利技术通过优化RBD蛋白的密码子本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.编码RBD蛋白的核酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.质粒载体，其特征在于，包括骨架载体和权利要求1所述的核酸。3.根据权利要求2所述的质粒载体，其特征在于，所述骨架载体包括pFastbac质粒或杆状病毒穿梭质粒。4.转化或转染有权利要求3所述的质粒载体的宿主，所述宿主包括昆虫细胞或大肠杆菌。5.一种用于Bac
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Bac表达系统的重组杆状病毒，其特征在于，所述病毒的基因组中包括权利要求1所述的核酸。6.RBD蛋白的制备方法，其特征在于，包括：用权利要求5所...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘先良，刘小平，汤敏，吴杏，郑周璇，陈晨，
申请(专利权)人：岳阳新华达制药有限公司，
类型：发明
国别省市：