一种广藿香醇合酶突变体及其编码基因以及应用制造技术

本发明专利技术提供一种广藿香醇合酶突变体及其编码基因以及应用，所述广藿香醇合酶突变体包括以SEQ ID NO.2所示野生型的广藿香醇合酶为模板，第136位赖氨酸突变形成的突变体K136A、K136T、K136S、K136V，第297位亮氨酸突变形成的突变体L297V、L297A，第405位半胱氨酸突变形成的突变体C405A、C405T、C405S，第464位精氨酸突变形成的突变体R464I，第525位酪氨酸突变形成的突变体Y525F，第531位酪氨酸突变形成的突变体Y531F。本发明专利技术通过酶工程手段改造广藿香醇合酶以提高广藿香醇的产量，为萜烯合酶类的改造提供了参考，具有重要的生产意义和实际的应用价值。用价值。用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种广藿香醇合酶突变体及其编码基因以及应用


[0001]本专利技术属于酶工程
，具体涉及一种广藿香醇合酶突变体及其编码基因以及应用。

技术介绍

[0002]广藿香醇是唇形科植物广藿香[Pogostemon cablin(Blanco)Benth.]的主要成分之一，因其特有的令人愉快且持久的木制、泥土和樟脑气味而被广泛认可，同时也具有抗菌、抗炎等多种作用，是一种三元环的倍半萜类化合物，并且由于广藿香油的低生产成本和香水及化妆品行业的高需求，使得广藿香油具有巨大的出口潜力。目前全世界范围内每年应用于化妆品和日用品的广藿香油用量高达万吨。广藿香醇的生物合成是由广藿香醇合酶催化的，广藿香醇合酶与萜烯合酶类似都含有相似的保守结构域DDXXD(X指代任意氨基酸)。目前，广藿香醇合酶的催化效率及对底物的特异性稳定性催化等都限制着广藿香醇合酶的利用，因此通过酶工程的手段改造广藿香醇合酶以提高广藿香醇的产量，具有重要的意义和实际的应用价值。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是提供一种广藿香醇合酶突变体及其编码基因以及应用，从而解决现有技术中广藿香醇合酶的催化效率较低、对底物的特异性不够、稳定性较低，从而导致广藿香醇的产量较低的问题。
[0004]为了解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：
[0005]根据本专利技术的第一方面，提供一种广藿香醇合酶突变体，所述广藿香醇合酶突变体包括以SEQ ID NO.2所示野生型的广藿香醇合酶为模板，第136位赖氨酸突变为丙氨酸形成的突变体K136A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；第136位赖氨酸突变为苏氨酸形成的突变体K136T，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；第136位赖氨酸突变为丝氨酸形成的突变体K136S，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；第136位赖氨酸突变为缬氨酸形成的突变体K136V，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；第297位亮氨酸突变为缬氨酸形成的突变体L297V，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；第297位亮氨酸突变为丙氨酸形成的突变体L297A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；第405位半胱氨酸突变为丙氨酸形成的突变体C405A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；第405位半胱氨酸突变为苏氨酸形成的突变体C405T，其氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；第405位半胱氨酸突变为丝氨酸形成的突变体C405S，其氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；第464位精氨酸突变为异亮氨酸形成的突变体R464I，其氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；第525位酪氨酸突变为苯丙氨酸形成的突变体Y525F，其氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示；第531位酪氨酸突变为苯丙氨酸形成的突变体Y531F，其氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。
[0006]根据本专利技术的第二方面，提供一种广藿香醇合酶突变体的编码基因，所述编码基因编码如上面所述的任意一种广藿香醇合酶突变体的氨基酸序列。
[0007]根据本专利技术的第三方面，提供一种包含如上面所述的广藿香醇合酶突变体的编码基因的重组基因工程菌。
[0008]优选地，所述重组基因工程菌以原核宿主细胞(如大肠杆菌)或真核宿主细胞(如酿酒酵母细胞)为宿主菌。
[0009]根据本专利技术的第四方面，提供一种如上面所述的广藿香醇合酶突变体在制备广藿香醇中的应用。
[0010]所述的应用包括以上面所述的广藿香醇合酶突变体为催化剂进行反应，催化法尼基焦磷酸环化在细胞内进行，获得包含广藿香醇的产物。
[0011]所述应用包括：将如上面所述的广藿香醇合酶突变体的编码基因转化入宿主细胞，培养该细胞，从而获得包含广藿香醇的产物。
[0012]根据本专利技术，所述产物包括：广藿香醇、α
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布藜烯、α
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愈创木烯。
[0013]根据本专利技术的一个优选方案，提供一种生产广藿香醇的方法，具体方法为：以酿酒酵母为宿主，表达编码所述广藿香醇合酶及其突变体的基因，得到重组菌株；然后将重组的酿酒酵母菌经种子培养基活化后转入发酵培养基中，30℃，转速200rpm条件下培养，培养7天时间后获得广藿香醇产物。
[0014]根据本专利技术提供的一种广藿香醇合酶突变体及其编码基因以及应用，通过酶工程手段改造广藿香醇合酶，得到的广藿香醇合酶突变体的催化效率提高、对底物的特异性得到增强、稳定性得到提高，最终提高了广藿香醇的产量，为萜烯合酶类的改造提供了参考，具有重要的生产意义以及重大的实际应用价值。
附图说明
[0015]图1为PTS酶的三维结构模型图；
[0016]图2为pESC
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URA
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FPTs质粒图谱；
[0017]图3为实施例3中基因重组工程菌在发酵7天时的广藿香醇产量。
具体实施方式
[0018]以下结合具体实施例，对本专利技术做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本专利技术而非用于限制本专利技术的范围。
[0019]下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件进行。引物为捷瑞生物工程有限公司合成。
[0020]为更好的理解本专利技术的内容，本文以BY4741为出发菌株改造后的一种酿酒酵母菌株HPT14(以BY4741为出发菌株过表达UPC2
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1，tHMG，以HXT1的启动子替换菌株本身ERG9的启动子，敲除off
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pathway相关基因，具体参见文献LIU M,LIN Y C,GUO J J,et al.High
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Level Production of Sesquiterpene Patchoulol in Saccharomyces cerevisiae[J].ACS Synth Biol,2021,10(1):158
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72.)为具体实施例作进一步说明。
[0021]实施例1PTS酶三维结构模型的建立
[0022]利用同源建模工具，以PDB ID:4GAX为参考模型对广藿香醇合酶进行同源建模。经模型评估后，获得可靠的三维结构模型，三维结构模型图如图1所示。
[0023]实施例2构建定点突变文库
[0024]利用PCR技术，以表达有野生型PTS基因的质粒pESC
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URA
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FPTs(该质粒的具体构建过程可参见中国专利申请CN 112175848 A：一种广藿香醇生产酵母菌株及其构建方法，其质粒图谱如图2所示)为模板，对PTS酶第136、297、405、464、525、531位进行定点突变。
[0025]设计突变引物，正向和反向引物是根据不同突变位点进行设计的PCR上游和下游引物，具体的引物信息如表1所示。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种广藿香醇合酶突变体，其特征在于，所述广藿香醇合酶突变体包括以SEQ ID NO.2所示野生型的广藿香醇合酶为模板，第136位赖氨酸突变为丙氨酸形成的突变体K136A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；第136位赖氨酸突变为苏氨酸形成的突变体K136T，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；第136位赖氨酸突变为丝氨酸形成的突变体K136S，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；第136位赖氨酸突变为缬氨酸形成的突变体K136V，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；第297位亮氨酸突变为缬氨酸形成的突变体L297V，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；第297位亮氨酸突变为丙氨酸形成的突变体L297A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；第405位半胱氨酸突变为丙氨酸形成的突变体C405A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；第405位半胱氨酸突变为苏氨酸形成的突变体C405T，其氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；第405位半胱氨酸突变为丝氨酸形成的突变体C405S，其氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；第464位精氨酸突变为异亮氨酸形成的突变体R464I，其氨基酸序列如SEQ ID N...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘敏，陶欣艺，郭姣姣，魏东芝，马昱澍，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：