一种黄曲霉毒素菌株及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开一种黄曲霉毒素菌株及其构建方法与应用，其中，构建方法包括步骤：采用原生质体转化法将敲除载体pAoG转化至米曲霉菌株A.oryzae 2351中，构建营养缺陷型菌株；构建RafA基因异源表达载体pEX1

【技术实现步骤摘要】
一种黄曲霉毒素菌株及其构建方法与应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，特别涉及一种黄曲霉毒素菌株及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]米曲霉(Aspergillus oryzae)是一种广泛应用于传统酿造行业的丝状真菌，主要用于清酒和酱油的生产。因其具有分泌各种水解酶(淀粉酶、蛋白酶等)的显著潜力，近年来被广泛用作异源表达的宿主以提高各种水解酶及次级代谢产物的产量。
[0003]近年来大量研究表明米曲霉和黄曲霉同属黄曲霉亚属，两者的基因组在编码区显示极高的相似性。系统发育分析中，米曲霉源于黄曲霉一个分支的单系分支，并且通过驯化，米曲霉逐渐从黄曲霉中解毒和分化出来。尽管如此，对于拥有完整黄曲霉毒素合成同源基因簇的米曲霉不分泌黄曲霉毒素这一现象仍未找到合理的解释。近年来大量的黄曲霉毒素合成调控因子的发现，为研究者探究拥有完整黄曲霉毒素合成同源基因簇的米曲霉却不分泌毒素提供了新方向。
[0004]基于此，米曲霉驯化过程中黄曲霉毒素合成调控基因的演化以及调控基因能否在拥有完整黄曲霉毒素合成同源基因簇的米曲霉中发挥功能作用以调控毒素分泌需要更深一步的研究。

技术实现思路

[0005]鉴于上述现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种黄曲霉毒素菌株及其构建方法与应用，旨在解决现有米曲霉不能分泌黄曲霉毒素的问题。
[0006]本专利技术的技术方案如下：
[0007]一种黄曲霉毒素菌株的构建方法，其中，包括步骤：
[0008]采用原生质体转化法将敲除载体pAoG转化至米曲霉菌株A.oryzae2351中，构建营养缺陷型菌株；
[0009]构建RafA基因异源表达载体pEX1
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RafA，以及StuA基因异源表达载体pEX2B
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StuA；
[0010]采用原生质体转化法将所述RafA基因异源表达载体pEX1
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RafA或StuA基因异源表达载体pEX2B
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StuA转化至所述营养缺陷型菌株中，构建制得黄曲霉毒素菌株。
[0011]所述黄曲霉毒素菌株的构建方法，其中，构建RafA基因异源表达载体pEX1
‑
RafA的步骤包括：
[0012]以含黄曲霉毒素合成调控基因RafA的质粒为模板，设计对应RafA引物并克隆基因RafA，所述基因RafA的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，所述RafA引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.2
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3；
[0013]将所述基因RafA与表达载体pEX1通过酶切和酶连处理，构建RafA基因异源表达载体pEX1
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RafA。
[0014]所述黄曲霉毒素菌株的构建方法，其中，构建StuA基因异源表达载体pEX2B
‑
StuA
的步骤包括：
[0015]以含黄曲霉毒素合成调控基因StuA的质粒为模板，设计对应StuA引物并克隆基因StuA，所述基因StuA的核苷酸序列为SEQ ID NO.4，所述StuA引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.5
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6；
[0016]将所述基因StuA与表达载体pEX2B通过酶切和酶连处理，构建StuA基因异源表达载体pEX2B
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StuA。
[0017]一种黄曲霉毒素菌株，其中，采用本专利技术所述黄曲霉毒素菌株的构建方法制得。
[0018]一种黄曲霉毒素菌株的应用，其中，将本专利技术构建方法制得的黄曲霉毒素菌株用于生产黄曲霉毒素。
[0019]有益效果：本专利技术探索了黄曲霉毒素合成调控基因RafA和StuA在拥有完整黄曲霉毒素合成同源基因簇的米曲霉中异源表达，在限氮条件下培养异源表达菌株2351
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RafA以及2351
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StuA，探究其黄曲霉毒素的分泌情况，这为研究菌株营养胁迫响应打下基础，从而为构建高产黄曲霉毒素以及其他次级代谢产物工业菌株提供技术支持。
附图说明
[0020]图1为为本专利技术一种黄曲霉毒素菌株的构建方法流程图。
[0021]图2为限氮培养条件下，原始米曲霉菌株A.oryzae 2351与本专利技术构建的异源表达菌株2351
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RafA、2351
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StuA的表型结果对比图。
[0022]图3为限氮培养条件下，原始米曲霉菌株A.oryzae 2351与本专利技术构建的异源表达菌株2351
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RafA、2351
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StuA的菌落直径对比图。
[0023]图4为限氮培养条件下，原始米曲霉菌株A.oryzae 2351与本专利技术构建的异源表达菌株2351
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RafA、2351
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StuA的孢子数量对比图。
[0024]图5为限氮培养条件下，原始米曲霉菌株A.oryzae 2351与本专利技术构建的异源表达菌株2351
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RafA、2351
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StuA的生物量对比图。
[0025]图6为限氮培养条件下，原始米曲霉菌株A.oryzae 2351与本专利技术构建的异源表达菌株2351
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RafA、2351
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StuA的黄曲霉毒素分泌量对比图。
[0026]图7为原始米曲霉菌株A.oryzae 2351与本专利技术构建的异源表达菌株2351
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RafA、2351
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StuA侵染玉米种子结果对比图。
[0027]图8为原始米曲霉菌株A.oryzae 2351与本专利技术构建的异源表达菌株2351
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RafA、2351
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StuA侵染花生种子结果对比图。
[0028]图9为实施例3中编码黄曲霉毒素合成途经相关酶的差异表达基因的表达水平图。
[0029]图10为实施例3中差异表达基因GO注释分类统计图。
[0030]图11为实施例3中差异表达基因KEGG通路富集散点图，其中，A为2351
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ΔpyrG_vs_2351
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StuA的差异表达基因KEGG通路富集散点图，B为2351
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ΔpyrG_vs_2351
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RafA的差异表达基因KEGG通路富集散点图，C为2351
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RafA_vs_2351
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StuA的差异表达基因KEGG通路富集散点图。
具体实施方式
[0031]本专利技术提供一种黄曲霉毒素菌株及其构建方法与应用，为使本专利技术的目的、技术
方案及效果更加清楚、明确，以下对本专利技术进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。
[0032]请参阅图1，图1为本专利技术提供的一种黄曲霉毒素菌株的构建方法流程图，如图所示，其包括步骤：
[0033]S10、采本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种黄曲霉毒素菌株的构建方法，其特征在于，包括步骤：采用原生质体转化法将敲除载体pAoG转化至米曲霉菌株A.oryzae 2351中，构建营养缺陷型菌株；构建RafA基因异源表达载体pEX1
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RafA，以及StuA基因异源表达载体pEX2B
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StuA；采用原生质体转化法将所述RafA基因异源表达载体pEX1
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RafA或StuA基因异源表达载体pEX2B
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StuA转化至所述营养缺陷型菌株中，构建制得黄曲霉毒素菌株。2.根据权利要求1所述黄曲霉毒素菌株的构建方法，其特征在于，构建RafA基因异源表达载体pEX1
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RafA的步骤包括：以含黄曲霉毒素合成调控基因RafA的质粒为模板，设计对应RafA引物并克隆基因RafA，所述基因RafA的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，所述RafA引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.2
‑
3；将所...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾斌，吕功波，
申请(专利权)人：深圳技术大学，
类型：发明
国别省市：