一种barcode微滴的单细胞测序方法技术

本发明专利技术属于单细胞测序方法的技术领域，具体涉及一种barcode微滴的单细胞测序方法，其为基于纳米和微米尺寸的barcode微滴用于单细胞及亚细胞结构的单细胞测序，适合于全长mRNA测序及随机引物法mRNA测序。测序及随机引物法mRNA测序。测序及随机引物法mRNA测序。

【技术实现步骤摘要】
一种barcode微滴的单细胞测序方法


[0001]本专利技术属于单细胞测序方法的
，具体涉及一种barcode微滴的单细胞测序方法。

技术介绍

[0002]10X技术是基于液滴捕获的原理，通过液滴包裹单个磁珠和1个细胞，磁珠和细胞发生反应：细胞裂解后释放mRNA，磁珠上的引物尾巴可以做到与mRNA的特异性结合，从而实现捕获的目的。同时通过磁珠引物本身所带有的cell barcode序列和UMI序列，可以对不同细胞的不同转录本做标记区分。因为磁珠上的引物片段携带mRNA序列信息，在它的基础上通过反转录或复制的方式扩增，所有的转录信息便带上了cell barcode、UMI。
[0003]BD技术是基于微孔捕获的原理，在微孔中，一个细胞与一个barcode标记的磁珠匹配；细胞裂解，mRNA被磁珠上的barcode序列捕获；然后将捕获了mRNA的磁珠进行回收，并完成cDNA合成、建库和测序；最后通过数据分析，根据barcode序列来区分不同细胞的mRNA序列。
[0004]10X技术采用的是液滴捕获的原理，能集单细胞分选、扩增、建库于一体，单细胞的捕获效率可高达65％，并且单个液滴捕获到多个细胞的概率极低，但是使用10x测序只能获得3
’
端的转录本信息，5
’
端的信息是丢失的；10X测序对样本的质量要求很高，对于单个样本的细胞起始量要达到105‑
106个，活细胞数目需要在80％以上。
[0005]BD技术是基于微孔捕获的原理，在微孔中利用分子标签对单细胞中的每个转录本进行特异性分子的标记，能实现单细胞水平上基因表达谱的绝对定量，同时每个细胞也会被标记上特异性细胞标签，使得高通量平行建库成为可能。BD测序有着自身特有的单细胞分离技术，单次实验可制备100
‑
10000个单细胞文库。用户可根据需求定制引物，将检测范围集中在目标基因上，方便于大幅度降低后续的测序成本。BD技术可以实现多样本混合捕获，微孔板的孔数可高达22万个；具备成像系统，可观察细胞相关信息。但是与10X相比，BD技术存在建库周期长，成本价格高，通量低等缺点。
[0006]10X和BD技术不适用于微孔板芯片测序在血小板、外泌体、细菌、病毒或支原体等更微小微滴的单细胞测序。
[0007]目前单细胞测序耗材主要被10X和BD垄断，然而两者均基于barcode编码的磁珠体系，磁珠的最大缺陷是单个磁珠上结合的barcode数量有限，为达到有效的测序深度，其体积至少做到30um(barcode上限为106次/磁珠)，而在微孔板芯片测序血小板、外泌体、细菌、病毒、原体和线粒体等体积更小的细胞和细胞器时，相应的磁珠和微孔会更小，而该体积的微球所能偶联的barcode并不能支撑测序所需的深度，因此需要开发体积更小，但是能装载足够多barcode的微滴进行单细胞测序。
[0008]因此，开发一种适用于更微小微滴的单细胞测序的方法尤为重要。

技术实现思路

[0009]针对上述问题，本专利技术的目的在于提供一种barcode微滴的单细胞测序方法。
[0010]本专利技术的
技术实现思路
如下：
[0011]本专利技术提供了一种barcode微滴的单细胞测序方法，包括如下步骤：
[0012]1)barcode微滴制备及特征
[0013]1.1)建立barcode微滴
[0014]将barcode微滴分为多个大的液滴库进行建库，利用微流控芯片系统分离微滴，包括barcode库1、barcode库2、barcode库3，...，以此类推；
[0015]所述barcode库1包括100个细分，为barcode1
‑
1，barcode1
‑
2，...，barcode1
‑
100)；
[0016]所述barcode1
‑
1制备出10
n
个液滴(n＞1)，每个液滴含有不低于106根barcode1
‑
1，同理制备100个细分barcode“1
‑
n”的液滴库(barcode1
‑1‑
barcode1
‑
100)，并混合成为液滴库barcode库1，含有10
n+2
个液滴；
[0017]同理，制备其他barcode“N
‑
n”液滴库N，如barcode库2，barcode库3等；
[0018]barcode微滴建库的数目取决于检测所需的库容，但大于2，原则是所有库的库容的组合满足测序细胞数量，如测序细胞数为105，则barcode1库
×
barcode2库
×
barcode“n”库≥105；
[0019]如常规最低检测需求为106，则barcode库1
×
barcode库2
×
barcode库3
×
barcode库n≥106，所以如果只有2个库，则每个微滴库不低于103的库容，即barcode1
‑
1到barcode1
‑
1000和barcode2
‑
1到barcode2
‑
1000。
[0020]1.2)微滴制备分离时分别从混合库1以及其后的数个库中取1个液滴，将取出的多个液滴与扩增mix混合形成一个扩增液滴，按照图1进行扩增；
[0021]扩增后对产物进行破乳，收集cDNA并进行建库，进行测序和分析；
[0022]2)对全长mRNA以及引物mRNA进行建库测序；
[0023]步骤2)所述全长mRNA的建库测序包括如下步骤：
[0024]将包含多个片段的Barcode用于标记细胞，以及一个与Barcode连接的UMI来标记转录本；
[0025]所述Barcode为2～6段的序列组成，优选2
‑
3段，分别为上游Barcode、中间Barcode和下游Barcode；
[0026]所述上游Barcode的3
’
端为3
‑
5个G，用于RACE反转录，5
’
端为adapter序列，用于连接测序接头；
[0027]上游Barcode的序列为：5'
‑
adapter+jjjjjj+GGG
‑3’
；
[0028]以3个Barcode为例，所述中间Barcode的3
’
端为polyT序列，用于mRNA的反转录，5
’
端为linker；
[0029]中间Barcode的序列为：3'
‑
polyT+jjjjjj+linker
‑5’
；
[0030]所述下游Barcode3
’
端为anti
‑
linker，与上本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种barcode微滴的单细胞测序方法，其特征在于，包括如下步骤：1)barcode微滴制备及特征1.1)建立barcode微滴将barcode微滴分为多个大的液滴库进行建库，利用微流控芯片系统分离微滴，包括barcode库1、barcode库2、barcode库3，
…
，以此类推；1.2)微滴制备分离时分别从混合库1以及其后的n个库中分别取1个液滴，n≥1，将取出的多个液滴与扩增mix混合形成一个扩增液滴；扩增后最后对产物进行破乳，收集cDNA并进行建库，进行测序和分析；2)对全长mRNA以及引物mRNA进行建库测序：将包含多个片段的Barcode用于标记细胞，以及一个与Barcode连接的UMI来标记转录本；3)利用转座酶法或者随机引物法扩增cDNA得到双链DNA文库，并采用Illumina高通量测序系统进行测序。2.根据权利要求1所述的barcode微滴的单细胞测序方法，其特征在于，步骤1)所述barcode库1包括100个细分，为barcode1
‑
1，barcode1
‑
2，....，barcode1
‑
100；所述barcode1
‑
1制备出10
n
个液滴，其中n＞1，每个液滴含有不低于106根barcode1
‑
1，同理制备100个细分barcode“1
‑
n”的液滴库barcode1
‑1‑
barcode1
‑
100，并混合成为液滴库barcode库1，含有10
n+2
个液滴；同理，制备其他barcode“N
‑
n”液滴库N。3.根据权利要求1所述的barcode微滴的单细胞测序方法，其特征在于，步骤2)所述Barcode为2～6段的序列组成。4.根据权利要求3所述的barcode微滴的单细胞测序方法，其特征在于，所述Barcode为多段的序列组成，分别为上游Barcode以及下游，若为多端Barcode，则中间Barcode含有linker序列，该通过linker序列经过PCR将附近的Barcode进行连接，以3段为例，分别为上游Barcode、中间Barcode和下游Barcode。5.根据权利要求4所述的barcode微滴的...

【专利技术属性】
技术研发人员：方志远，陈国强，罗微，周丹，邓裕华，杜岗，
申请(专利权)人：广州市碳码科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：