一种对微球进行编码的方法技术

本申请提供一种对微球进行编码的方法，所述方法包括以下步骤：提供连接有第一核苷酸序列的微球，在所述第一核苷酸序列上连接第二核苷酸序列，在所述第二核苷酸序列上连接第三核苷酸序列，在所述第三核苷酸序列上连接目标分子捕获序列，其中所述第二核苷酸序列包括串联连接的1个或多个碱基T、串联连接的1个或多个碱基A、串联连接的1个或多个碱基G和串联连接的1个或多个碱基C。本申请的对微球进行编码的方法操作简单、批间差异小，错误率低、成本低廉。廉。

【技术实现步骤摘要】
一种对微球进行编码的方法


[0001]本申请属于单细胞分析方法
，具体涉及一种对微球进行编码的方法。

技术介绍

[0002]细胞是生命体的组成以及生命活动的最基本单位。每个细胞所行使的功能是不同的，随着高通量测序技术的发展，单细胞测序技术已经成为单细胞分析的重要手段。单细胞测序技术极大提高了我们对生命过程的理解，单细胞测序技术对药物研发、肿瘤治疗及个性化用药起了极大的推动作用。
[0003]单细胞测序分为单细胞分离、单细胞裂解、基因组或转录组扩增、高通量测序和数据分析四个步骤。而在高通量单细胞测序中，如何高效率地给每个细胞加上特异的标签是单细胞测序通量和效率的关键。目前给每个细胞添加特异性标签的主流方法是使用微流控技术或者微孔板技术用带有特异DNA编码的微球对细胞内扩增或者非扩增的DNA、RNA、cDNA、蛋白质进行捕获后通过一系列生物学实验操作让每个细胞内被检测的物质带上特定的DNA标签。来自同一个细胞的遗传物质被标记上相同的标签，在进行高通量测序后可以通过数据分析的方法对单个不同的细胞进行区分。在高通量单细胞测序实验中DNA编码微球是非常重要的实验材料。DNA编码微球的合成方法有采用混合裂分法在微球上通过化学合成的方法合成DNA编码(Brenner et al.(2000)Proc.Acad.Set USA 97:1665)，这种方法的缺点在于DNA化学合成的方法效率不够高，每一轮碱基的合成效率为98％
‑
99％，当合成长度达到60个碱基的时候，微球上只有29.7％
‑r/>50％的序列是正确的目标序列，而超过50％的错误序列会影响到单细胞测序结果的数据分析。另外，化学合成方法会使用到一些有毒有害的化学试剂，对环境和实验人员的身体健康都有不好的影响。此外，厦门大学的杨超勇团队提出了一种使用微流控数字PCR，使用DNA聚合酶和DNA连接酶进行DNA编码微球的合成方法(CN105925572A)。该方法需要借助专门的微流控设备或者数字PCR设备，对实验人员的操作要求较高，且成本较高，合成通量较低。新格元(南京)生物科技有限公司提出了另外一种基于DNA聚合酶和DNA连接酶进行DNA编码微球合成的方法，该方法的缺点是需要合成大量带特殊修饰的DNA序列，成本较高，同时DNA编码的多样性较低。

技术实现思路

[0004]针对现有技术存在的上述问题，本申请提供一种对微球进行编码的方法。
[0005]具体来说，本申请涉及如下方面：
[0006]1.一种对微球进行编码的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
[0007]提供连接有第一核苷酸序列的微球，
[0008]在所述第一核苷酸序列上连接第二核苷酸序列，
[0009]在所述第二核苷酸序列上连接第三核苷酸序列，
[0010]在所述第三核苷酸序列上连接目标分子捕获序列，
[0011]其中所述第二核苷酸序列包括串联连接的1个或多个碱基T、串联连接的1个或多
个碱基A、串联连接的1个或多个碱基G和串联连接的1个或多个碱基C。
[0012]2.根据项1所述的制备方法，其特征在于，在所述第一核苷酸序列上连接第二核苷酸序列包括以下步骤：
[0013]通过DNA末端转移酶将四种碱基T、A、G、C连接到所述第一核苷酸序列上。
[0014]3.根据项1所述的制备方法，其特征在于，在所述第一核苷酸序列上连接第二核苷酸序列包括以下步骤：
[0015]通过DNA末端转移酶将选自碱基T、A、G、C中的1个或多个第一碱基接到所述第一核苷酸序列上，
[0016]通过DNA末端转移酶在所述1个或多个第一碱基上连接选自碱基T、A、G、C中除所述第一碱基之外的1个或多个第二碱基，
[0017]通过DNA末端转移酶在所述1个或多个第二碱基上连接选自碱基T、A、G、C中除所述第一碱基和所述第二碱基之外的1个或多个第三碱基，
[0018]通过DNA末端转移酶在所述1个或多个第三碱基上连接选自碱基T、A、G、C中除所述第一碱基、所述第二碱基和所述第三碱基之外的1个或多个第四碱基。
[0019]4.根据项3所述的制备方法，其特征在于，在所述第一核苷酸序列上连接第二核苷酸序列还包括：
[0020]在连接了1个或多个第四碱基之后，通过DNA末端转移酶将选自碱基T、A、G、C中除所述第四碱基之外的1个或多个延长碱基连接到第四碱基上，以及
[0021]在所述1个或多个延长碱基上，通过DNA末端转移酶连接选自碱基T、A、G、C中的与所述延长碱基不同的任意碱基；
[0022]重复一次或多次在所述1个或多个延长碱基上，通过DNA末端转移酶连接选自碱基T、A、G、C中的与所述延长碱基不同的任意碱基的步骤。
[0023]5.根据项2所述的制备方法，其特征在于，所述DNA末端转移酶为TDT末端转移酶。
[0024]6.根据项1所述的制备方法，其特征在于，所述第三核苷酸序列包括T、A、G、C中的一种或两种以上。
[0025]7.根据项1所述的制备方法，其特征在于，所述目标分子捕获序列靶向待分析的目标分子。
[0026]8.根据项1所述的制备方法，其特征在于，所述第一核苷酸序列的长度为10
‑
40bp。
[0027]9.根据项1所述的制备方法，其特征在于，所述第二核苷酸序列的长度为20
‑
50bp。
[0028]10.根据项1所述的制备方法，其特征在于，所述第三核苷酸序列的长度为20
‑
50bp。
[0029]11.根据项1所述的制备方法，其特征在于，所述目标分子捕获序列的长度为10
‑
50bp。
[0030]12.根据项1所述的制备方法，其特征在于，连接有第一核苷酸序列的微球通过将微球生成物质和所述第一核苷酸序列共聚合得到。
[0031]13.根据项1所述的制备方法，其特征在于，所述微球的粒径为10
‑
100μm。
[0032]本申请的对微球进行编码的方法操作简单、批间差异小，错误率低、成本低廉。本申请通过将串联的T转换成T，将串联的A转换成A，将串联的G转换成G，将串联的C转换成C，从而可以使用TDT末端转移酶制备第二核苷酸序列，使用TDT末端转移酶制备第二核苷酸序
列相对于采用化学合成来制备第二核苷酸序列具有更高的反应效率。
[0033]本申请的对微球进行编码的方法可以通过序列上碱基的信息来对核酸测序错误(碱基的缺失、碱基错误识别等)、微球上序列碱基合成缺失、合成错误等进行高效率识别，并能通过算法进行序列纠正和错误修复。在单细胞测序中，此方案可以增加细胞的有效数据比例，降低测序成本，增加单个细胞检测到有效数据的信息。
具体实施方式
[0034]下面结合实施例进一步说明本申请，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本申请，并非用于限制本申请。
[0035]除非本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种对微球进行编码的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：提供连接有第一核苷酸序列的微球，在所述第一核苷酸序列上连接第二核苷酸序列，在所述第二核苷酸序列上连接第三核苷酸序列，在所述第三核苷酸序列上连接目标分子捕获序列，其中所述第二核苷酸序列包括串联连接的1个或多个碱基T、串联连接的1个或多个碱基A、串联连接的1个或多个碱基G和串联连接的1个或多个碱基C。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述第一核苷酸序列上连接第二核苷酸序列包括以下步骤：通过DNA末端转移酶将四种碱基T、A、G、C连接到所述第一核苷酸序列上。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述第一核苷酸序列上连接第二核苷酸序列包括以下步骤：通过DNA末端转移酶将选自碱基T、A、G、C中的1个或多个第一碱基接到所述第一核苷酸序列上，通过DNA末端转移酶在所述1个或多个第一碱基上连接选自碱基T、A、G、C中除所述第一碱基之外的1个或多个第二碱基，通过DNA末端转移酶在所述1个或多个第二碱基上连接选自碱基T、A、G、C中除所述第一碱基和所述第二碱基之外的1个或多个第三碱基，通过DNA末端转移酶在所述1个或多个第三碱基上连接选自碱基T、A、G、C中除所述第一碱基、所述第二碱基和所述第三碱基之外的1个或多个第四碱基。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在所述第一核苷酸序列上连接第二核苷酸序列还包括：在连接了1个或多个第四碱基之后，通过DNA末端转移酶将选自碱基T、A、G、C中除所...

【专利技术属性】
技术研发人员：信长朋，温绍昂，赵毅，张川，
申请(专利权)人：上海高探生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：