一种利用基因测序检测舒筋健腰药品药效的方法技术

一种利用基因测序检测舒筋健腰药品药效的方法，依次包括如下步骤：A：取家兔，采用手术法制备兔膝骨关节炎模型：步骤B：动物分组后开始灌胃给药。步骤C：在家兔的取损伤部位处提取RNA；步骤D：构建测序样本文库。步骤E：进行双端测序。步骤F：计算出每个基因的FPKM值。步骤G：根据差异基因判断药品舒筋健腰丸药效。本发明专利技术的检测方法，操作方便、准确性和稳定性良好，能够很好的检测舒筋健腰丸药品的药效和作用机制。制。制。

【技术实现步骤摘要】
一种利用基因测序检测舒筋健腰药品药效的方法


[0001]本专利技术属于医药领域，涉及利用基因测序检测舒筋健腰药品药效的方法。

技术介绍

[0002]目前，我国舒筋健腰药品(狗脊、金樱子、鸡血藤、千斤拔、黑老虎、牛大力、女贞子(蒸)、桑寄生(蒸)、菟丝子(盐制)、延胡索(制)、两面针、乳香(制)、没药(制))的药物作用及作用机制的研究几乎处于起步阶段，文献以临床疗效观察为主，如舒筋健腰药品联合氯芬酸钠治疗腰椎间盘突出症的疗效观察，舒筋健腰丸治疗肝肾不足、风湿瘀阻腰椎间盘突出症的中医疗效观察等。舒筋健腰药品有效成分复杂，现有实验室方法难以判断药效。目前报道的文献也未涉及差异基因等研究。

技术实现思路

[0003]本专利技术提供了一种利用基因芯片检测舒筋建腰药品药效的方法，能够很好的用于检测舒筋建腰药品的药效。
[0004]为解决上述问题，本专利技术所采用的技术方案如下：
[0005]一种利用基因芯片检测舒筋建腰药品药效的方法，依次包括如下步骤：
[0006]步骤A：获得兔膝骨关节炎模型；
[0007]步骤B：选取造模成功的动物随机分为5组，分别为模型组，阳性对照盐酸氨基葡萄糖组，舒筋健腰丸低、中、高剂量组，每组14只动物，雌雄各半；分组后开始灌胃给药，每天1次，连续给药4周；
[0008]步骤C：在家兔的取损伤部位处提取RNA；
[0009]步骤D：按照实验操作说明对纯化后的Total RNA进行mRNA的分离、片段化、第一链cDNA合成、第二链cDNA合成、末端修复、3
’
末端加A、连接接头、富集等步骤，完成测序样本文库构建；
[0010]步骤E：按照cBot User Guide所示相应流程，在Illumina测序仪配套的cBot上完成Cluster生成和第一向测序引物杂交。按照Illumina User Guide准备测序试剂，将携有cluster的flow cell上机。选用paired
‑
end程序，进行双端测序。测序过程由Illumina提供的data collection software进行控制，并进行实时数据分析。
[0011]步骤F：应用Stringtie(version:1.3.0)对Hisat2比对后每个基因的Fragments数进行计数，然后用TMM(trimmed mean of M values)法进行归一化，最后利用perl脚本计算出每个基因的FPKM值。
[0012]步骤G，舒筋健腰丸药效差异基因具有如下特征：
[0013]1)磷酸转移酶活性相关：HCK,HK3,MAPK13、EPHA5,EPHA3,EFEMP1,EPHA4,DGKI；
[0014]2)RNA合成过程相关：MXD1,KLF5,NR2E1,ADAM8,LTF,ADGRG3,CEBPE,NFAM1；
[0015]3)细胞组织调控过程相关：KLF5,NR2E1，EPHA4，EPHA3；
[0016]4)基质金属蛋白转运相关：KCNJ2,SLC6A4,SLC28A3，ITGAV；
[0017]5)组织再生相关：EOMES,WNT2B,HTRA1,LIF；
[0018]6)氧化还原反应相关：DHRS9,ALOX5,ACTN3,PYGL,ALOX15。
[0019]本专利技术中，舒筋建腰药品优选广州白云山陈李济药厂股份有限公司生产的“舒筋健腰丸”。
[0020]与传统的舒筋建腰药品药效检测相比，本专利技术的优点是：本专利技术利用基因测序技术，采用新西兰家兔作为骨性关节炎模型的获取对象，然后利用仪器进行测序、检测、数据处理，根据差异基因对药品舒筋健腰丸治疗骨性关节炎的功效进行检测，与传统的临床研究、动物实验研究采用肉眼或显微镜观察等，更精准和客观，具有明显的进步，同时该检测方法快速、简便。本专利技术的检测方法还可以应用于人体服用舒筋健腰丸后的功效的检测。
附图说明
[0021]图1：实施例1所得基因组覆盖分布图；以1K的窗口得出基因组的一个覆盖分布，图中最外圈为基因组，里面每一个圈表示一个样本的染色体覆盖。
[0022]图2：实施例1所得基因表达相关性heatmap图；颜色越深表明相关性越大，数值指相关性系数。
[0023]图3：实施例1所测差异基因火山图，其中红色表示上调差异基因，蓝色表示下调差异基因。
[0024]图4：实施例2所得基因组覆盖分布图；以1K的窗口得出基因组的一个覆盖分布，图中最外圈为基因组，里面每一个圈表示一个样本的染色体覆盖。
[0025]图5：实施例2所得基因表达相关性heatmap图，颜色越深表明相关性越大，数值指相关性系数。
[0026]图6：实施例2所测差异基因散点图，红色表示上调差异基因，蓝色表示下调差异基因。
具体实施方式
[0027]下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
[0028]除非另有定义，本专利技术所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本专利技术。本专利技术所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
[0029]为了便于理解本专利技术，下面将对本专利技术进行更全面的描述。本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术公开内容的理解更加透彻全面。
[0030]下面结合附图及具体实施方式对本专利技术作进一步详细说明。
[0031]以下实施例中，舒筋建腰药品优选广州白云山陈李济药厂股份有限公司生产的“舒筋健腰丸”。
[0032]实施例1
[0033]一种利用基因测序检测舒筋健腰药品药效的方法，依次包括如下步骤：
[0034]A：取家兔，采用手术法制备兔膝骨关节炎模型：麻醉动物后，左侧膝部内侧做长约2cm纵向切口，显露髌骨关节面。先用钻头在膝关节屈曲90
°
时髌骨对应股骨内、外侧髁间关节面中部钻出小凹陷，然后在此基础上钻出直径4.2mm、深3mm的软骨缺损区。将髌骨复位，逐层缝合关节囊和皮肤切口。制备兔膝骨关节炎模型；
[0035]步骤B：选取造模成功的动物随机分为5组，分别为模型组，阳性对照盐酸氨基葡萄糖组，舒筋健腰丸低、中、高剂量组，每组14只动物，雌雄各半。分组后开始灌胃给药，每天1次，连续给药4周。
[0036]步骤C：在家兔的取损伤部位处提取RNA；
[0037]步骤D：按照实验操作说明对纯化后的Total RNA进行mRNA的分离、片段化、第一链cDNA合成、第二链cDN本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用基因测序检测舒筋健腰药品药效的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)获得家兔膝骨关节炎模型；(2)家兔膝骨关节炎模型分组后开始灌胃给予舒筋健腰药品；(3)在家兔的取损伤部位处提取RNA；(4)构建测序样本文库；(5)进行双端测序；(6)计算出每个基因的FPKM值；(7)检测差异基因。2.根据权利要求1所述的利用基因测序检测舒筋健腰药品药效的方法，其特征在于：所述舒筋健腰丸为广州白云山陈李济药厂生产的舒筋健腰丸。3.根据权利要求1所述的利用基因测序检测舒筋健腰药品药效的方法，其特征在于，检测舒筋健腰丸药效的差异基因包括如下：磷酸转移酶活性相关：HCK,HK3,MAPK13、EPHA5,EPHA3,EFEMP1,EPHA4,DGKI；RNA合成过程相关：MXD1,KLF5,NR2E1,ADAM8,LTF,ADGRG3,CEBPE,NFAM1；细胞组织调控过程相关：KLF5,NR2E1，EPHA4，EPHA3；基质金属蛋白转运相关：KCNJ2,SLC6A4,SLC28A3，ITGAV；组织再生相关：EOMES,WNT2B,HTRA1,LIF；氧化还原反应相关：DHRS9,ALOX5,ACTN3,PYGL,ALOX15。4.根据权利要求1所述的利用基因测序检测舒筋健腰药品药效的方法，其特征在于，步骤(2)分组为：分别为模型组，阳性对照盐酸氨基葡萄糖组，舒筋健腰丸低、中、高剂量组。5.根据权利要求1所述的利用基因测序检测舒筋健腰药品药效的方法，其特征在于，步骤(2)中灌胃给予舒筋健腰药品，每天1次，连续给药4周。6.根据权利要求1所述的利用基因测序检测舒筋健腰药品药效的方法，其特征在于，步骤(4)构建测序样本文库包括：提取RNA的纯化，对纯化后的RNA进行mRNA的分离、片段化、第一链cDNA合成、第二链cDNA合成、末端修复、3
’
末端加A、连接接头...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭秋平，欧慧瑜，石洪超，陈迪新，覃仁安，何风雷，倪庆纯，
申请(专利权)人：广州医药研究总院有限公司，
类型：发明
国别省市：