本发明专利技术属于医药领域，具体涉及一种针对所有GBS血清型的多表位亚单位疫苗。本发明专利技术首先提供一种针对所有GBS血清型的多表位嵌合蛋白MVSA，所述的多表位嵌合蛋白MVSA的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。小鼠体内主动免疫保护试验显示，MVSA可为小鼠抵抗致死量GBS感染提供100%保护率。同时小鼠被动免疫保护试验显示，提前注射MVSA抗体能明显的降低GBS攻毒后小鼠的脏器载菌量及脏器的促炎细胞因子水平，且为小鼠抵抗致死量GBS感染提供100%保护率。在体外，MVSA抗体可明显抑制不同血清型GBS的生长。因此，MVSA作为一种多表位疫苗，刺激机体产生的保护性抗体能抵御GBS的感染，具有良好的应用前景。用前景。用前景。
【技术实现步骤摘要】
一种针对所有GBS血清型的多表位亚单位疫苗
[0001]本专利技术属于医药领域，具体涉及一种针对所有GBS血清型的多表位亚单位疫苗。
技术介绍
[0002]无乳链球菌，又称B群链球菌(Group B Streptococcus，GBS)，是一种革兰阳性细菌，可感染多种物种，包括鱼类、爬行动物、两栖动物、鸟类和哺乳动物。除动物外，GBS可在多达30％的健康女性的阴道和胃肠道定植。同时，GBS 是危及新生儿生命的主要病原体，可导致脑膜炎、败血症和肺炎。疫苗预防GBS 感染对于人类和动物的至关重要。目前的GBS疫苗针对的是细菌的多糖荚膜，但是不同血清型之间缺乏交叉保护。因此，研发一种同时为所有10种血清型GBS 提供广泛保护的广谱、多价的新型疫苗刻不容缓。近年来，成熟的基因组学、生物信息学和蛋白质组学技术使识别和执行广泛分布的抗病原体的保守免疫原性蛋白成为可能。一些病原体的表面或分泌蛋白和毒力因子被认为是候选保护抗原，如表面免疫蛋白Sip、细胞壁表面锚固定家族蛋白、CAMP因子、C5a肽酶、富含丝氨酸的重复糖蛋白Srr、鸟氨酸氨甲酰转移酶OTC等。然而，单一蛋白不能诱导有效的免疫反应，为宿主提供保护。
[0003]多表位融合抗原(Multiepitope fusion antigen，MEFA)技术是基于电脑生物学和结构生物学相结合的一种新型疫苗构建技术和平台，是将来源于不同种属的菌株或者同一菌株中表达的不同毒力因子的中和(阻断)抗原表位，利用电脑生物学和结构生物学技术整合至一个抗原中，并最大限度的模拟抗原表位本身的免疫原性，旨在构建具有广泛保护力的新型多价表位疫苗。基于MEFA技术平台设计的表位疫苗可以将多个不同来源的表位抗原整合在一起，从而使该疫苗对异源病原体具有广泛保护性，这使传统的表位疫苗的理念焕然一新。
技术实现思路
[0004]针对现有问题的不足，本专利技术的目的是提供一种针对所有GBS血清型的多表位亚单位疫苗。
[0005]本专利技术解决其技术问题采用的技术方案是：
[0006]第一方面，本专利技术保护一种针对所有GBS血清型的多表位嵌合蛋白MVSA，所述的多表位嵌合蛋白MVSA的氨基酸序列如SEQ ID No：1。
[0007]本专利技术还保护编码前文所述的针对所有GBS血清型的多表位嵌合蛋白 MVSA的基因。
[0008]本专利技术还保护含有前文所述基因的表达盒、表达载体、转基因细胞系或重组工程菌。
[0009]第二方面，本专利技术保护一种针对所有GBS血清型的疫苗，其含有前文所述的多表位嵌合蛋白MVSA。
[0010]根据人类的主要组织相容性抗原等位基因(HLA)预测MVSA的全球覆盖率为88.91％。在GBS流行的地区美国(24.7％)、澳大利亚(23.8％)、加拿大(20.5％)， MVSA疫苗
可分别覆盖100％、92.79％和99.2％的人口。
[0011]作为本申请的优选技术方案，所述疫苗为亚单位疫苗。
[0012]血清学试验表明，接种本专利技术的疫苗后产生了MVSA抗体。体外抑菌试验表明，本专利技术提供的MVSA抗体能显著抑制6种不同血清型GBS菌株的生长，这六种流行血清型(Ia，Ib，II，III，V，VI)覆盖GBS临床感染98.4％病例。
[0013]优选的，所述疫苗中还包含亚单位疫苗佐剂。
[0014]更优选的，所述亚单位疫苗佐剂为seppic ISA206。
[0015]第三方面，本专利技术保护一种针对所有GBS血清型的多表位亚单位疫苗的制备方法，包括如下步骤：
[0016](1)计算机预测GBS抗原表位：确定覆盖10种不同的GBS的血清型的候选蛋白；将其进行T/B细胞抗原表位预测，然后多序列比对和抗原性预测筛选出同时包含T、B细胞表位的11个多肽表位；
[0017](2)构建MVSA蛋白：在每个表位的N端添加一个Linker片段“LRMKLPKS”，并在每对Linker表位序列之间插入第二间隔物GPGPG；将步骤(1)的表位串联并构建多肽嵌合体MVSA；
[0018](3)构建重组质粒：以扩增产物为模板，扩增并得到MVSA蛋白基因，所述 MVSA蛋白基因连接到pET
‑
28a(+)质粒得到重组质粒；
[0019](4)MVSA蛋白基因表达：将构建的重组质粒转化至BL21感受态细胞，经培养、提取和纯化，得到MVSA蛋白。
[0020]作为本申请的优选技术方案，所述步骤(1)的表位分别来自于GBS自身蛋白NT5，BKD
‑
E2，PK，GAPDH，PGK，Srr1，FbsA，Sip，AP1
‑
2b，Beta C protein， BibA。
[0021]作为本申请的优选技术方案，所述制备方法中还包括将MVSA进一步制备成商业化疫苗的步骤。
[0022]本专利技术还保护前文所述的一种针对所有GBS血清型的多表位亚单位疫苗的制备方法得到的多表位亚单位疫苗。
[0023]体外抑菌试验表明，本专利技术的MVSA抗体能显著抑制6种血清型GBS菌株的生长。
[0024]本专利技术还保护如下任一应用：
[0025](1)前文所述的多表位嵌合蛋白在作为或制备针对所有GBS血清型的亚单位疫苗中的应用；
[0026](2)前文所述的多表位嵌合蛋白在作为或制备由于预防所有GBS血清型的药物中的应用；
[0027](3)前文所述的基因、前文所述的表达盒、表达载体、转基因细胞系或重组工程菌在制备前文所述的多表位嵌合蛋白的中的应用。
[0028]第三方面，本专利技术还保护一种针对所有GBS血清型的疫苗或药物，其活性成分为前文所述的多表位嵌合蛋白。
[0029]有益效果
[0030]本专利技术提供的一种针对所有GBS血清型的多表位亚单位疫苗，与现有技术相比，具有以下有益效果：
[0031](1)本专利技术的亚单位疫苗，将多种抗原的保护性表位串联而成，既能够排除整个蛋
白分子中免疫无关成分或免疫耐受成分，诱导出更有效的免疫保护性应答，又能克服表达载体多种抗原抗体嵌合表达的容量限制。
[0032](2)本专利技术选取的NT5，BKD
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E2，PK，GAPDH，PGK，Srr1，FbsA，Sip，AP1
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2b，Beta C protein，BibA的分布覆盖了几乎所有的GBS临床分离株；本专利技术的多肽嵌合体MVSA，经计算机人类等位基因HLA预测，能覆盖全球约88.91％的人口。因此MVSA是研制GBS疫苗的理想靶抗原之一。
[0033](4)本专利技术通过间接ELISA方法、WB方法和主动免疫保护试验检测小鼠免疫MVSA后血清抗体产生水平和攻毒后免疫保护率，结果发现MVSA能刺激机体产生不同水平的特异性抗体，免疫MVSA对免疫小鼠的免疫保护率100％。 (3)在体外环境中，MVSA诱导机体产生的MVSA抗体可抑制不同血清型GBS 的生长。在小鼠体内，提前注射MVSA本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种针对所有GBS血清型的多表位嵌合蛋白MVSA，其特征在于，所述的多表位嵌合蛋白MVSA的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。2.编码权利要求1所述的针对所有GBS血清型的多表位嵌合蛋白MVSA的基因。3.含有权利要求2所述基因的表达盒、表达载体、转基因细胞系或重组工程菌。4.一种针对所有GBS血清型的疫苗，含有权利要求1所述的多表位嵌合蛋白。5.根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗为亚单位疫苗；优选的，所述疫苗还包含亚单位疫苗佐剂，更优选的，所述亚单位疫苗佐剂为seppic ISA206。6.一种针对所有GBS血清型的多表位亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）计算机预测GBS抗原表位：确定覆盖GBS的所有10种血清型的候选蛋白；将其进行T/B细胞抗原表位预测，然后多序列比对筛选出同时包含T、B细胞表位的多肽表位；（2）构建MVSA蛋白：在每个表位的N端添加一个Linker片段“LRMKLPKS”，并在每对Linker表位序列之间插入第二间隔物GPGPG；将步骤（1）的表位串联并构建多肽嵌合体MVSA；（3）构建重组质粒：以扩增产物为模板，扩增并得到MVSA蛋白基因，所述MVSA蛋白基因连接到...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘广锦，张郁敏，梁松，张时雨，张释丹，
申请(专利权)人：三亚南京农业大学研究院，
类型：发明
国别省市：
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