用于引起IGF2基因内含子3区域中的特定位点突变失活的sgRNA及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于引起IGF2基因内含子3区域中的特定位点突变失活的sgRNA及其应用。本发明专利技术提供了一种sgRNA(命名为特异sgRNA)，其中的靶序列结合区如序列表的序列2中第5至24位核苷酸所示。本发明专利技术还保护用于表达所述sgRNA的DNA分子(命名为特异DNA分子)。本发明专利技术还保护含有所述特异DNA分子和表达Cas9蛋白的DNA分子的重组载体(命名为特异重组载体)。本发明专利技术提供的所述特异重组载体导入牛成纤维细胞后，可以成功破坏IGF2基因中ZBED6蛋白的结合位点，破坏ZBED6蛋白与IGF2基因的结合，从而解除ZBED6蛋白对IGF2基因表达的抑制作用。作用。

【技术实现步骤摘要】
用于引起IGF2基因内含子3区域中的特定位点突变失活的sgRNA及其应用


[0001]本专利技术涉及一种用于引起IGF2基因内含子3区域中的特定位点突变失活的sgRNA及其应用。

技术介绍

[0002]基因编辑技术像一把基因的剪刀一样，可以精确地和高效的对目的基因序列进行删除、插入和替换。传统基因编辑技术
‑
例如同源重组技术，打靶的效率在10
‑6‑
10
‑7，打靶效率非常低，限制了其在哺乳动物细胞中的普遍应用。随着技术的发展，科学家们开始挖掘人工核酸酶。人工核酸酶包括两个结构域，一个是识别特异DNA序列的结构域，另一个是非特异核酸内切酶区域，因此人工核酸酶能特异切割基因组DNA产生双链断裂，大大提高了发生同源重组或突变的概率。1993年出现的锌指核酸酶(zinc
‑
finger nucleases,ZFN)技术被人们用了20多年，直到转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator
‑
like effector nuclease,TALEN)技术的出现，TALEN技术更加特异，脱靶效率低。2012年8月更简单、快捷的规律性成簇间隔的短回文重复序列/CRISPR相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated,CRISPR/Cas)技术出现，迅速取代了ZFN和TALEN技术。
[0003]CRISPR/Cas9系统是一种细菌降解入侵的病毒和噬菌体DNA的适应性免疫系统。CRISPR/Cas9系统主要包括：由CRISPR基因座转录获得的RNA(CRISPR RNA,crRNA)和反式激活的CRISPR重复区互补的反式编码RNA(trans
‑
activating crRNA，tracrRNA)以及具有核酸酶活性的Cas9蛋白组成。Cas9蛋白具有核酸内切酶活性，用于切割DNA双链，产生双链断裂；CRISPR基因座由多个高度保守的重复序列和间隔序列组成，部分间隔区是某些病毒和噬菌体感染细菌时被留下来的。当相同的病毒或噬菌体再次感染细菌时，CRISPR基因座表达crRNA，tracrRNA与CRISPR RNA的重复序列互补，之后剪接为成熟的crRNA
‑
tracrRNA，crRNA
‑
tracrRNA引导Cas9蛋白对外源DNA进行切割，从而达到对入侵病毒和噬菌体的防御。麻省理工学院的研究人员把CRISPR/Cas9技术应用到哺乳动物细胞中，引起一场基因编辑的技术革命。为方便操作，科学家将crRNA和tracrRNA进行适当的改造，整合成一条单链RNA即单链引导RNA(single guide RNA，sgRNA)，将CRISPR/Cas9系统简化为两部分：sgRNA和Cas9蛋白。目前，CRISPR/Cas技术已经高效的实现了多基因的同时敲除以及介导同源重组实现了多基因碱基的精确替换。CRISPR/Cas技术用于识别目的基因的结构是一段RNA，相较于第一代的ZFN和第二代的TALEN技术专门设计的串联蛋白模块，要简单很多。由于CRISPR技术的设计简单、节省时间和高效的突变效率被广泛应用到各地实验室，成为基础研究以及医药等领域的有效工具，快速推动各领域的发展。
[0004]牛肉含有丰富的蛋白质，其氨基酸组成比猪肉更接近于人体需要，脂肪含量低。此外，牛肉中还富含矿物质(钾、锌、镁、铁等)和B族维生素，可提高机体抗病能力。由于我国居民收入的增长，更加追求健康的饮食，对牛肉的需求越来越大。但是，目前国内的牛肉产量
并不能满足消费者的需求。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种用于引起IGF2基因内含子3区域中的特定位点突变失活的sgRNA及其应用。
[0006]本专利技术提供了一种sgRNA(命名为特异sgRNA)，其中的靶序列结合区如序列表的序列2中第5至24位核苷酸所示。
[0007]具体的，所述特异sgRNA如序列表的序列2所示。
[0008]本专利技术还保护用于表达所述sgRNA的DNA分子(命名为特异DNA分子甲)。
[0009]具体的，所述特异DNA分子甲如序列表的序列3中第246
‑
345位核苷酸所示。
[0010]具体的，所述特异DNA分子甲如序列表的序列3所示。
[0011]本专利技术还保护含有所述特异DNA分子甲的重组载体。
[0012]本专利技术还保护一种DNA分子组合，包括所述特异DNA分子甲和表达Cas9蛋白的DNA分子。
[0013]本专利技术还保护一种重组载体组合，包括含有所述特异DNA分子甲的重组载体和表达Cas9蛋白的重组载体。
[0014]本专利技术还保护一种DNA分子(命名为特异DNA分子乙)，其中具有区段甲和区段乙；所述区段甲用于表达所述特异sgRNA，所述区段乙用于表达Cas9蛋白。
[0015]本专利技术还保护一种重组载体(命名为特异重组载体)，即含有所述特异DNA分子甲和表达Cas9蛋白的DNA分子的重组载体。
[0016]具体的，所述特异重组载体可为如下重组质粒：将序列表的序列3中第250
‑
269位核苷酸所示的双链DNA分子插入pX458载体的两个BbsI酶切位点之间(取代两个BbsI酶切位点之间的小片段)，得到的重组质粒。
[0017]本专利技术还保护所述特异sgRNA、所述特异DNA分子甲、含有所述特异DNA分子甲的重组载体、所述DNA分子组合、所述重组载体组合、所述特异DNA分子乙或所述特异重组载体在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为如下(a)和/或(b)和/或(c)和/或(d)：(a)制备重组细胞；(b)破坏牛ZBED6蛋白与牛IGF2基因的结合；(c)解除牛ZBED6蛋白对牛IGF2基因表达的抑制作用；(d)提高牛或牛细胞中的牛IGF2蛋白丰度。
[0018]本专利技术还保护一种制备重组细胞的方法，包括如下步骤：将所述DNA分子组合、所述重组载体组合、所述特异DNA分子乙或所述特异重组载体导入牛成纤维细胞，得到重组细胞。
[0019]所述方法制备的重组细胞也属于本专利技术的保护范围。
[0020]本专利技术还提供了一种制备克隆牛的方法，包括如下步骤：
[0021](1)将所述DNA分子组合、所述重组载体组合、所述特异DNA分子乙或所述特异重组载体导入牛成纤维细胞，得到重组细胞；
[0022](2)将步骤(1)获得的重组细胞作为供体细胞，通过体细胞核移植制备克隆牛。
[0023]牛IGF2蛋白由牛IGF2基因编码。
[0024]牛IFG2基因在NCBI中的GeneID为281240。
[0025]牛ZBED6蛋白由牛ZBED6基因编码。
[0026]牛ZBED6基因在NCBI中的Gene ID为100140288。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.sgRNA，其中的靶序列结合区如序列表的序列2中第5至24位核苷酸所示。2.用于表达权利要求1所述sgRNA的DNA分子。3.含有权利要求2所述DNA分子的重组载体。4.DNA分子组合或者重组载体组合；所述DNA分子组合包括权利要求2所述DNA分子和表达Cas9蛋白的DNA分子；所述重组载体组合包括权利要求3所述重组载体和表达Cas9蛋白的重组载体。5.DNA分子，其中具有区段甲和区段乙；所述区段甲用于表达权利要求1所述sgRNA，所述区段乙用于表达Cas9蛋白。6.含有权利要求2所述DNA分子和表达Cas9蛋白的DNA分子的重组载体。7.权利要求1所述sgRNA、权利要求2所述DNA分子、权利要求3所述重组载体、权利要求4所述DNA分子组合、权利要求4所述重组载体组合、权利要求5所述DNA分子或权利要求6所述重组载体在制备试剂盒...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹惠影，丁方荣，戴蕴平，王海萍，
申请(专利权)人：北京顺鑫鑫源种牛研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：