催化合成天然蔗糖酯的工程菌及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提出了一种催化合成天然蔗糖酯的工程菌及其构建方法和应用。本发明专利技术通过将蔗糖和支链脂肪酸转化合成蔗糖酯的过程中所用的酶的目标基因转化到大肠杆菌中，构建一种能够催化蔗糖和支链脂肪酸合成蔗糖酯的工程菌株。通过使用该工程菌株可实现蔗糖与短链支链脂肪酸所形成的蔗糖酯的依次酯化以及对蔗糖特定位点的选择性酯化，得到与天然蔗糖酯无差异的合成蔗糖酯类化合物。本发明专利技术使用构建的工程菌株催化合成蔗糖酯，不需要使用强碱等强腐蚀性试剂、有毒化学试剂以及大量的酶，使用方便，操作简单。操作简单。操作简单。

【技术实现步骤摘要】
催化合成天然蔗糖酯的工程菌及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，尤其涉及一种催化合成天然蔗糖酯的工程菌及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]蔗糖酯是蔗糖的羟基与脂肪酸羧基进行酯化反应所得到的酯，包括蔗糖一酯、蔗糖二酯、蔗糖三酯等，蔗糖酯中的脂酰基团可由不同的酯酰基团组成，包括短链支链的酯酰基基团，如异戊酰基、异丁酰基以及2
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甲基丁酰基以及中长链酯酰基基团，如癸酰基以及月桂酰基。蔗糖酯可作为非离子型表面活性剂使用，具有比其他表面活性剂更佳的表面活性，也不会造成环境污染和其他不良影响，因此被广泛应用于食品、医药以及化妆品行业中。目前获取蔗糖酯的方法主要包括化学合成法以及通过脂肪酶进行的酶催化法，化学合成法又具体包括溶剂法、相转移催化法、乳化法等。使用化学合成法合成蔗糖酯时，所使用的催化剂往往有毒，且常需要在高温、高压、强酸或强碱的环境下进行，条件严苛，过程复杂，制备成本较高，强酸或强碱还会对设备造成腐蚀性损坏；而利用脂肪酶进行酶催化合成蔗糖酯时，脂肪酶的较高成本和复杂的纯化过程也是必须要考虑的重要因素。如专利“专利号CN 112941129A”公开一种利用无定形蔗糖酶催化合成蔗糖酯的方法，不仅需利用分子筛纯化酶，还使用了有毒的叔戊醇或叔丁醇，且反应过程也不够简便。此外，由于蔗糖具有8个游离的自由羟基，化学法以及酶催化法都无法保证脂肪酸与特定的羟基进行酯化反应，难以对底物蔗糖不同羟基位点进行立体选择，获得的蔗糖酯与自然界植物体内的天然蔗糖酯存在一定的差异。因此，开发一种利用微生物发酵催化制备、同时可控制蔗糖和脂肪酸定点酯化、过程简便、成本较低且绿色安全的天然蔗糖酯合成方法是目前亟待解决的问题。

技术实现思路

[0003]为解决上述技术问题，本专利技术提出一种催化合成天然蔗糖酯的工程菌及其构建方法和应用。
[0004]本专利技术的技术方案是这样实现的：催化合成天然蔗糖酯的工程菌的构建方法，包括以下步骤：（1）构建包含基因HlCCL2和基因HlCCL4的重组质粒pESE02；（2）构建包含基因SlASAT1、基因SlASAT2和基因SlASAT3的重组质粒pESE10；（3）构建包含基因optSlASAT1、基因optSlASAT2和基因optSlASAT3的重组质粒pESE15；（4）分别制备包含步骤（1）的重组质粒pESE02和步骤（2）的重组质粒pESE10的工程菌株EcoSE07以及包含步骤（1）的重组质粒pESE02、步骤（3）的重组质粒pESE15和分子伴侣质粒的工程菌株EcoSE16。
[0005]进一步，所述步骤（1）中基因HlCCL2的碱基序列如SEQ ID NO.4所示，基因HlCCL4的碱基序列如SEQ ID NO.5所示。
[0006]进一步，所述步骤（2）中基因SlASAT1的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，基因SlASAT2的碱基序列如SEQ ID NO.2所示，基因SlASAT3的碱基序列如SEQ ID NO.3所示。
[0007]进一步，所述步骤（3）中基因optSlASAT1的碱基序列如SEQ ID NO.6所示，基因optSlASAT2的碱基序列如SEQ ID NO.7所示，基因optSlASAT3的碱基序列如SEQ ID NO.8所示。
[0008]进一步，所述分子伴侣质粒为分子伴侣质粒pKJE7。
[0009]上述的方法构建的工程菌，所述工程菌为工程菌株EcoSE07或工程菌株EcoSE16。
[0010]上述的工程菌在催化合成天然蔗糖酯中的应用。
[0011]所述天然蔗糖酯包括蔗糖一酯、蔗糖二酯和蔗糖三酯。
[0012]其步骤为：a、将在LB固体培养基（含有34 μg/mL氯霉素、50 μg/mL卡那霉素和50 μg/mL壮观霉素）上培养起来的工程菌株EcoSE07或工程菌株EcoSE16单菌落接种于5mL LB液体培养基（含有34 μg/mL氯霉素、50 μg/mL卡那霉素和50 μg/mL壮观霉素）中，于37℃过夜培养12h；b、将培养后得到的工程菌株EcoSE07或工程菌株EcoSE16接种到LB液体培养基中（含有34 μg/mL氯霉素、50 μg/mL卡那霉素和50 μg/mL壮观霉素），起始OD值为0.01，待菌株OD值达到0.6时，加入0.1mM IPTG，经16℃低温诱导12h，然后4000rpm离心收集菌体；c、向LB液体培养基（含有34 μg/mL氯霉素、50 μg/mL卡那霉素和50 μg/mL壮观霉素）中加入10mM短支链脂肪酸异戊酸、10mM异丁酸、10mM 2
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甲基丁酸和15g/L蔗糖，再加入步骤b收集的菌体，然后进行转化，24h后即可收集天然蔗糖酯。
[0013]优选的，所述步骤c中进行转化时菌体的OD值为5。
[0014]上述步骤中提及的浓度均为终浓度。
[0015]本专利技术具有以下有益效果：1、本专利技术通过将蔗糖和支链脂肪酸转化合成蔗糖酯的过程中所用的酶如酰基辅酶A连接酶及酰基蔗糖酰基转移酶的目标基因转化到大肠杆菌中，构建一种能够催化蔗糖和支链脂肪酸合成蔗糖酯的工程菌株。蔗糖酯包括蔗糖一酯、蔗糖二酯以及蔗糖三酯，其中蔗糖酯中的脂酰基团为短链支链的酯酰基基团，如异戊酰基、异丁酰基以及2
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甲基丁酰基。
[0016]2、通过使用本申请工程菌株可实现蔗糖与短链支链脂肪酸酯的依次酯化，具体为蔗糖的葡萄糖吡喃环4号位羟基、葡萄糖吡喃环3号位羟基以及果糖呋喃环3
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位羟基位点的依次酯化，同时也实现了对特定位点的选择性酯化，得到与天然蔗糖酯无差异的合成蔗糖酯类化合物。通过这种方法可以避免有毒催化剂的使用、避免特殊设备的使用以及不需要进行酶的纯化，从一定程度上简化催化过程及节约成本。
[0017]3、本专利技术使用构建的工程菌株催化合成蔗糖酯，不需要使用强碱等强腐蚀性试剂、有毒化学试剂以及大量的酶，使用方便，操作简单，并通过对工程菌株的进一步优化，使产品蔗糖酯的品质更佳、产量更高，具有较好的应用和推广价值。
附图说明
[0018]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以
根据这些附图获得其他的附图。
[0019]图1为质粒pESE02的图谱。
[0020]图2为质粒pESE10的图谱。
[0021]图3为EcoSE07号菌株转化蔗糖及异戊酸、异丁酸及2
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甲基丁酸后，LC
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MS鉴定及分析，其中a为EcoSE07中经LC
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MS鉴定出的蔗糖单酯、蔗糖二酯及蔗糖三酯化合物；b为不同蔗糖酯类化合物与加入内标化合物的体积比；c为EcoSE07中分别检测到的蔗糖酯化合物的LC
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MS鉴定后本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.催化合成天然蔗糖酯的工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）构建包含基因HlCCL2和基因HlCCL4的重组质粒pESE02；（2）构建包含基因SlASAT1、基因SlASAT2和基因SlASAT3的重组质粒pESE10；（3）构建包含基因optSlASAT1、基因optSlASAT2和基因optSlASAT3的重组质粒pESE15；（4）分别制备包含步骤（1）的重组质粒pESE02和步骤（2）的重组质粒pESE10的工程菌株EcoSE07以及包含步骤（1）的重组质粒pESE02、步骤（3）的重组质粒pESE15和分子伴侣质粒的工程菌株EcoSE16。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述步骤（1）中基因HlCCL2的碱基序列如SEQ ID NO.4所示，基因HlCCL4的碱基序列如SEQ ID NO.5所示。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述步骤（2）中基因SIASAT1的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，基因SIASAT2的碱基序列如SEQ ID NO.2所示，基因SIASAT3的碱基序列如SEQ ID NO.3所示。4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述步骤（3）中基因optSlASAT1的碱基序列如SEQ ID NO.6所示，基因optSlASAT2的碱基序列如SEQ ID NO.7所示，基因optSlASAT3的碱基序列如SEQ ID NO....

【专利技术属性】
技术研发人员：韩丽，黄申，肖成志，董滋强，冯颖杰，陈芝飞，毛多斌，
申请(专利权)人：郑州轻工业大学，
类型：发明
国别省市：