基于CH3结构域的异二聚体分子、其制备方法及用途技术

本申请涉及抗体工程领域，具体涉及基于CH3的异二聚体分子、其制备方法及用途。本申请的发明专利技术通过综合考虑分子间各种相互作用，例如离子作用、疏水相互作用和空间作用等，筛选到优选的Fc突变序列，其更倾向于形成异二聚体，而不形成同二聚体，因而大大提高了异二聚体分子的产量，为双特异性分子等的制备创造了条件。件。件。

【技术实现步骤摘要】
基于CH3结构域的异二聚体分子、其制备方法及用途
[0001]本申请是申请日2016年12月16日、申请号为201680073286.3、专利技术名称为“基于CH3结构域的异二聚体分子、其制备方法及用途”的中国专利申请的分案申请。


[0002]本申请所述专利技术属于抗体工程领域，具体涉及基于CH3结构域的异二聚体分子、其制备方法及用途。

技术介绍

[0003]单克隆抗体药物在近十五年内增长迅速，成为制药行业的成长点。自1996年起，一共有30个左右单抗药物被批准上市，其中有九个单抗药物年销售额超过十亿美元。2010年单抗药物总销售额超过300亿美元，并且年增长率超过10％。由于单克隆抗体的靶标特异性强，因此只能抑制单一靶点。然而，在多种疾病中，包括肿瘤、自体免疫性疾病等，需要抑制多重信号通路来避免代偿效应。对于病毒感染疾病，由于病毒的高突变率，往往需要抑制多抗原位点来防止逃逸。另外，双功能抗体、蛋白被用于特异激活人体免疫系统(Wolf,Hofmeister et al.2005)。
[0004]众所周知，抗体的可结晶片段(Fc)区形成同二聚体，同时Fc对维持抗体和Fc融合蛋白的体内稳定性起关键作用。通过改造Fc使之形成异二聚体是产生多功能抗体、蛋白，并且维持其体内稳定性的有效方法。
[0005]异二聚体的一个典型应用的例子是双特异抗体，双特异抗体(Bispecific antibody,BsAbs)是含有两个不同配体结合位点的免疫球蛋白分子。双特异抗体至少可以对两个不同抗原具有活性(Carter 2001)，它取代了经典的抗体中Fab两臂相同的形式，而是采用具有不同序列的Fab两臂形式，因此Y型两臂可以结合不同的抗原。双特异抗体在癌症治疗中的应用已经被多篇文献所综述(Carter 2001；Chames and Baty 2009；Chames and Baty 2009)。
[0006]自然状态下不存在双特异性抗体，只能通过特殊方法进行制备。以往双特异抗体的制备方法有化学交联法，杂合F(ab')2分子法和鼠杂交瘤法等。化学交联法生产的双特异抗体的异源性，各批次间产品的不稳定性，以及抗体特异性易受某些修饰或不当连接而改变的特性，使得通过该方法生产的双特异抗体不适于体内使用。以巯基交联蛋白酶消化片段F(ab')生产的双特异杂交分子，成分虽较均一，但费时费力，且产量很低。杂交瘤法生产的双特异抗体，来源可靠，但由轻链、重链随机配对会产生多种可能的抗体形式，使得双特异抗体生产、纯化变得非常困难。
[0007]早在20世纪90年代，Carter等人用“把手
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孔洞”(knob into hole)模型改造抗体重链的部分氨基酸，比较成功地实现了双特异抗体的制备(Ridgway,Presta et al.1996；Carter 2001)。“把手
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孔洞”模型最初是由Crick提出，并用来解决相邻的α
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螺旋之间的氨基酸侧链折叠问题(Crick 1952)。Carter等在Fc区第一条重链的CH3区域上通过将一个侧链小的氨基酸突变成一个侧链大的氨基酸而创造出了一个“把手”(如T366Y)，并将第二条
重链上的CH3上的某些氨基酸突变成了侧链小的氨基酸创造出了“孔洞”(Y407T等)。“把手
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孔洞”模型的原理是“把手
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孔洞”的相互作用支持异二聚体的形成，而“把手
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把手”模型及“孔洞
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孔洞”模型阻碍同二聚体的形成。他们进一步在“把手
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孔洞”突变的基础上引入了CH3区域内的二硫键来巩固异二聚体的结合能力。然而在他们的研究结果中，“把手
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孔洞”模型对阻碍同二聚体的形成的能力仍然不够。之后该研究组尝试通过随机突变
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噬菌体展示等方法一步提高异二聚体的含量，但仍没有解决根本问题。为了提高异二聚体的比例，还有研究通过分别制备两种抗体，在体外通过分子间二硫键还原
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重新配对的方式形成异二聚体，但其制备工艺明显过于复杂。
[0008]因此，本领域仍需要寻找合适的突变以进一步增强异二聚体蛋白的形成而削弱同二聚体蛋白的形成。

技术实现思路

[0009]本申请所述专利技术通过综合考虑界面氨基酸之间的各种相互作用，例如离子作用、疏水相互作用和空间作用等，筛选到有益的CH3突变序列，其更倾向于形成异二聚体，而不形成同二聚体，因而大大提高了异二聚体分子的产量。
[0010]一方面，本申请所述专利技术涉及异二聚体分子，其含有第一多肽链和第二多肽链，所述第一多肽链包含抗体重链恒定区第一CH3结构域，所述第二多肽链包含抗体重链恒定区第二CH3结构域，与相应的野生型人抗体重链恒定区CH3结构域相比，所述第一CH3结构域和第二CH3结构域含有选自如下(1)至(3)所示位置氨基酸的突变中的一种：
[0011](1)第一CH3结构域的Y349和T366发生突变，且第二CH3结构域的D356、T366、L368和Y407发生突变，并且所述第一CH3结构域和/或第二CH3结构域还在选自F405、K409、K360、Q347和L368中的1至3个氨基酸位置具有的突变；
[0012](2)第一CH3结构域的T366和K409发生突变，且第二CH3结构域的T366、L368、Y407和F405发生突变，并且任选地所述第一CH3结构域和/或第二CH3结构域还在选自K392、D399、Y349、S354和E357中的1至2个氨基酸的位置具有突变；以及
[0013](3)第一CH3结构域的T366和F405发生突变，且第二CH3结构域的T366、L368、Y407和K409发生突变，并且任选地所述第一CH3结构域和/或第二CH3结构域还在选自K392、D399、Y349、S354和E357中的1至2个氨基酸的位置具有突变；
[0014]以上所述的氨基酸位置根据抗体Fc的KABAT编号的EU索引确定。
[0015]在某些实施方式中，所述第一CH3结构域和第二CH3结构域含有上述第(2)项或第(3)项突变，并且不含有突变Y349C和D356C。
[0016]在某些实施方式中，所述第一CH3结构域和/或第二CH3结构域还包含选自下列的突变中的一种：
[0017]1a)第二CH3结构域的F405发生突变；
[0018]1b)第一CH3结构域的F405发生突变；
[0019]1c)第一CH3结构域的K409发生突变，且第二CH3结构域的F405发生突变；
[0020]1d)第一CH3结构域的F405、K360和Q347发生突变，且第二CH3结构域的Q347发生突变；
[0021]1e)第一CH3结构域的F405和Q347发生突变，且第二CH3结构域的K360和Q347发生
突变；
[0022]1f)第一CH3结构域的K409、K360和Q347发生突变，且第二本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.异二聚体分子，其包含第一多肽链和第二多肽链，所述第一多肽链包含抗体重链恒定区第一CH3结构域，所述第二多肽链包含抗体重链恒定区第二CH3结构域，与相应的野生型人抗体重链恒定区CH3结构域相比，所述第一CH3结构域和第二CH3结构域含有选自以下组的所示位置氨基酸的突变：(I)第一CH3结构域的T366和F405发生突变，且第二CH3结构域的T366、L368、Y407和K409发生突变，并且任选地所述第一CH3结构域和/或第二CH3结构域还在选自K392、D399、Y349、S354和E357中的1至2个氨基酸的位置具有突变；(II)第一CH3结构域的Y349和T366发生突变，且第二CH3结构域的D356、T366、L368和Y407发生突变，并且所述第一CH3结构域和/或第二CH3结构域还在选自F405、K409、K360、Q347和L368中的1至3个氨基酸的位置具有突变；以及(III)第一CH3结构域的T366和K409发生突变，且第二CH3结构域的T366、L368、Y407和F405发生突变，并且任选地所述第一CH3结构域和/或第二CH3结构域还在选自K392、D399、Y349、S354和E357中的1至2个氨基酸的位置具有突变；以上所述的氨基酸的位置根据抗体Fc的KABAT编号的EU索引确定。2.根据权利要求1所述的异二聚体分子，其中所述第一CH3结构域和/或第二CH3结构域还包含选自下列的突变中的一种：1a)第二CH3结构域的F405发生突变；1b)第一CH3结构域的F405发生突变；1c)第一CH3结构域的K409发生突变，且第二CH3结构域的F405发生突变；1d)第一CH3结构域的F405、K360和Q347发生突变，且第二CH3结构域的Q347发生突变；1e)第一CH3结构域的F405和Q347发生突变，且第二CH3结构域的K360和Q347发生突变；1f)第一CH3结构域的K409、K360和Q347发生突变，且第二CH3结构域的F405和Q347发生突变；1g)第一CH3结构域的K409和Q347发生突变，且第二CH3结构域的F405、K360和Q347发生突变；和1h)第一CH3结构域的K409和L368发生突变，且第二CH3结构域的F405发生突变。3.根据权利要求1
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2中任一项所述的异二聚体分子，其中所述第一CH3结构域和/或第二CH3结构域还任选地包含选自下列的突变中的一种：2a)第一CH3结构域的K392发生突变，且第二CH3结构域的D399发生突变；2b)第一CH3结构域的Y349发生突变，且第二CH3结构域的E357发生突变；和2c)第一CH3结构域的Y349和S354发生突变，且第二CH3结构域的E357发生突变。4.根据权利要求1
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3中任一项所述的异二聚体分子，其中所述第一CH3结构域和/或第二CH3结构域任选地还包含选自下列的突变中的一种：3a)第一CH3结构域的D399发生突变，且第二CH3结构域的K392发生突变；3b)第一CH3结构域的Y349发生突变，且第二CH3结构域的E357发生突变；和3c)第一CH3结构域的Y349和S354D发生突变，且第二CH3结构域的E357发生突变。5.根据权利要求1
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4中任一项所述的异二聚体分子，其中所述的各突变各自独立地选自非带电氨基酸突变为带电氨基酸、带电氨基酸突变为非带电氨基酸或带电荷氨基酸突变为带相反电荷的氨基酸。6.根据权利要求1
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5中任一项所述的异二聚体分子，其中所述第一CH3结构域和/或第二CH3结构域中的突变包含选自下述的一个或数个突变：Y349C、Y349D、D356C、T366W、
T366S、L368A、L368E、L368G、F405K、Y407V、Y407A、K409E、K409A、K360E、Q347E、Q347R、K392D、D399S、E357A和S354D。7.根据权利要求1
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6中任一项所述的异二聚体分子，其中所述第一CH3结构域中包含选自下组的一处或多处的突变：Y349、T366、F405、K409、L368、K392、S354和/或D399。8.根据权利要求1
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7中任一项所述的异二聚体分子，其中所述第二CH3结构域中包含选自下组的一处或多处的突变：D356、T366、L368、Y407、F405、D399、E357、K409和/或K392。9.根据权利要求1
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8中任一项所述的异二聚体分子，其中所述第一CH3结构域中包含选自下组的一处或多处的突变：Y349、T366、F405、K409、L368、K392、S354和/或D399；且所述第二CH3结构域中包含选自下组的一处或多处的突变：D356、T366、L368、Y407、F405、D399、E357、K409和/或K392。10.根据权利要求1
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9中任一项所述的异二聚体分子，其中所述第一CH3结构域中包含选自下组的一个或多个突变：Y349C、T366W、F405K、K409A、L368E、K392D、Y349D、S354D和/或D399S。11.根据权利要求1
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10中任一项所述的异二聚体分子，其中所述第二CH3结构域中包含选自下组的一个或多个突变：D356C、T366S、L368A、Y407V、F405K、D399S、L368G、Y407A、E357A、K409A和/或K392D。12.根据权利要求1
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11中任一项所述的异二聚体分子，其中所述第一CH3结构域中包含选自下组的一个或多个突变：Y349C、T366W、F405K、K409A、L368E、K392D、Y349D、S354D和/或D399S；且所述第二CH3结构域中包含选自下组的一个或多个突变：D356C、T366S、L368A、Y407V、F405K、D399S、L368G、Y407A、E357A、K409A和/或K392D。13.根据权利要求1
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12中任一项所述的异二聚体分子，其中所述的第一CH3结构域和第二CH3结构域含有选自以下一组的突变：1)第一CH3结构域：Y349C+T366W，第二CH3结构域：D356C+T366S+L368A+Y407V+F405K；2)第一CH3结构域：Y349C+T366W+F405K，第二CH3结构域：D356C+T366S+L368A+Y407V；3)第一CH3结构域：Y349C+T366W+K409E，第二CH3结构域：D356C+T366S+L368A+Y407V+F405K；4)第一CH3结构域：Y349C+T366W+K409A，第二CH3结构域：D356C+T366S+L368A+Y407V+F405K；5)第一CH3结构域：Y349C+T366W+F405K+K360...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐霆，
申请(专利权)人：苏州康宁杰瑞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：