一种自然杀伤细胞的体外培养方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种自然杀伤细胞的体外培养方法及试剂盒，所述培养方法包括从外周血中分离外周血单个核细胞；将外周血单个核细胞接种至含有活化因子的培养基中进行培养；待培养一段时间后，向培养基中添加增殖因子继续培养。本发明专利技术NK细胞的体外培养方法中通过添加特定活化因子和增殖因子，以及添加时间限定，能够更好的提高NK细胞的阳性率和扩增倍数，解决了现有技术NK细胞体外培养纯度和扩增效率低的问题。的问题。的问题。

【技术实现步骤摘要】
一种自然杀伤细胞的体外培养方法及试剂盒


[0001]本专利技术涉及细胞培养
，具体涉及一种自然杀伤细胞的体外培养方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]自然杀伤细胞（Natural killer cell，NK细胞 )，是继T细胞、B细胞之外的第三大类淋巴细胞，占血液中淋巴细胞总数的5%~15%。NK细胞来源于骨髓造血干细胞，属于固有免疫细胞，除外周血中，还在肺脏、肝脏、脾脏、淋巴结和骨髓等器官均有分布。
[0003]NK细胞属于1型固有淋巴细胞，特征之一是产生1型细胞因子（如TNF和IFN
‑
γ）。在人体内NK细胞主要特征为CD3
‑
CD56+淋巴细胞群，根据CD56表达密度的不同，NK可分为CD56
bright
和CD56
dim
两个亚群。CD56
dim NK细胞主要存在于外周血，高表达CD16，杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR）和LFA
‑
1等分子，低表达CD94/NKG2A，以发挥杀伤功能为主，产生细胞因子的水平较低；而CD56
bright NK细胞主要在次级淋巴组织中聚集，低表达CD16和KIR，活化后以分泌细胞因子如IFN
‑
γ、TNF
‑
β、IL
‑
10、IL
‑
13和GM
‑
CSF等为主要功能，但细胞毒性低。
[0004]NK细胞作为固有免疫细胞，可直接杀伤肿瘤细胞和病毒感染的细胞，在机体免疫监视和早期抗感染免疫过程中发挥重要作用。NK细胞具有异于T细胞的抗肿瘤效应，不受MHC限制的细胞毒性、产生细胞因子和免疫记忆等功能，使其成为先天性和适应性免疫反应系统中的关键角色。因此，NK细胞成为了研究人员开发新型免疫疗法的理想选择之一。
[0005]目前，正在开发的NK细胞治疗产品主要有两类：一类是自体或是异体NK细胞治疗产品，另一类是CAR
‑
NK产品。CAR
‑
NK赋予NK细胞靶向特定肿瘤的能力，较CAR
‑
T细胞具有多种优势，包括细胞因子释放综合征风险（CRS）更小，神经毒性更小等。即使CAR
‑
NK细胞失去了CAR，NK细胞仍然可通过内在表达的激活性受体识别和杀伤肿瘤细胞。除了CAR
‑
NK，研发人员正在探索增强NK细胞功能的其他基因工程策略，包括通过表达趋化因子受体，促进肿瘤浸润。基于ADCC效应，NK可以和抗体联用构成组合疗法。但NK细胞占外周血中淋巴细胞含量的5%~15%，这增加了其体外培养的难度，普通培养方法得到的NK比例低，细胞扩增慢收获细胞数目少，很难达到临床应用要求。
[0006]目前，体外培养NK细胞的方法主要包括：（1）NK细胞分选后培养；（2）与基因改造的K562饲养层细胞共培养；（3）扩增NK
‑
92细胞系；（4）使用CD16抗体包被和细胞因子刺激培养等。其中K562和NK
‑
92为肿瘤细胞系，临床使用存在安全风险；NK细胞分选后培养虽能提高NK比例，但磁珠分选操作复杂并且成本较高；使用CD16抗体包被和细胞因子刺激，很难得到高纯度NK细胞。
[0007]有鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于提供一种自然杀伤细胞的体外培养方法及试剂盒，本专利技术培养方法通过特定活化因子和增殖因子的添加，能够更好的提高NK细胞的阳性率和扩增倍数。
[0009]为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：本专利技术第一方面提供一种自然杀伤细胞的体外培养方法，所述培养方法包括如下步骤：（a）从外周血中分离外周血单个核细胞；（b）将外周血单个核细胞接种至含有活化因子的培养基中进行培养，其中，所述活化因子为抗人CD52 单克隆抗体，或抗人CD52 单克隆抗体和OK432；（c）待培养一段时间后，向培养基中添加增殖因子继续培养，其中，当活化因子为抗人CD52 单克隆抗体时，所述增殖因子包括IL
‑
2、OK432和IL
‑
21；当活化因子为抗人CD52 单克隆抗体和OK432时，所述增殖因子包括IL
‑
2和IL
‑
21。
[0010]优选地，所述在步骤（c）中，增殖因子还包括IL
‑
15和/或抗人 4
‑
1BB 单克隆抗体。
[0011]优选地，所述步骤（b）中，培养基中抗人CD52 单克隆抗体的浓度为50~1000ng/ml。
[0012]优选地，所述步骤（b）或（c）中，培养基中OK432的浓度为0.005~0.02 KE/ml。
[0013]优选地，所述步骤（c）中，培养一段时间为培养20~30h； IL
‑
2的添加终浓度为800~1200U/ml；IL
‑
21的添加终浓度为15~25 ng/ml。
[0014]优选地，所述IL
‑
15的添加终浓度为15~25 ng/ml；抗人 4
‑
1BB 单克隆抗体的添加终浓度为80~120ng/ml。
[0015]优选地，所述步骤（c）中，培养过程中，间隔1~3天向培养基中补添含有自体灭活血浆和IL
‑
2的X
‑
VIVO 15培养基至细胞浓度不高于1
×
106cells/ml。
[0016]优选地，所述X
‑
VIVO 15培养基中自体灭活血浆的体积含量为4%~6%，IL
‑
2浓度为800~1200U/ml。
[0017]优选地，所述步骤（b）中，外周血单个核细胞接种浓度为（2~4）
×
106cells/ml；培养基为X
‑
VIVO 15培养基。
[0018]本专利技术第二方面提供一种自然杀伤细胞体外培养的试剂盒，所述试剂盒中包括如下试剂：抗人CD52 单克隆抗体、OK432、 IL
‑
2、IL
‑
21、IL
‑
15和抗人 4
‑
1BB 单克隆抗体。
[0019]与现有技术相比，本专利技术的有益效果至少包括：本专利技术NK细胞的体外培养方法中通过添加特定活化因子和增殖因子，以及添加时间限定，能够更好的提高NK细胞的阳性率和扩增倍数，解决了现有技术NK细胞体外培养纯度和扩增效率低的问题。
附图说明
[0020]为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。
[0021]图1为本专利技术实验例1中志愿者血液中PBMC培养前流式结果；图2为本专利技术实验例1中志愿者本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种自然杀伤细胞的体外培养方法，其特征在于，包括如下步骤：（a）从外周血中分离外周血单个核细胞；（b）将外周血单个核细胞接种至含有活化因子的培养基中进行培养，其中，所述活化因子为抗人 CD52 单克隆抗体，或抗人 CD52 单克隆抗体和OK432；（c）待培养一段时间后，向培养基中添加增殖因子继续培养，其中，当活化因子为抗人 CD52 单克隆抗体时，所述增殖因子包括IL
‑
2、OK432和IL
‑
21；当活化因子为抗人 CD52 单克隆抗体和OK432时，所述增殖因子包括IL
‑
2和IL
‑
21。2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述在步骤（c）中，增殖因子还包括IL
‑
15和/或抗人 4
‑
1BB 单克隆抗体。3.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤（b）中，培养基中抗人 CD52 单克隆抗体的浓度为50~1000ng/ml。4.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤（b）或（c）中，培养基中OK432的浓度为0.005~0.02KE/ml。5.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤（c）中，培养一段时间为培养20~30h；IL
‑
2的添加终浓度为800~1200U/ml；IL
‑
21的添...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄欣欣，梁艳艳，
申请(专利权)人：启朔北京生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：