一种非洲猪瘟病毒p72蛋白稳定表达细胞系及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种非洲猪瘟病毒p72蛋白稳定表达细胞系及其构建方法，在将p72蛋白完成序列改造得到重组蛋白后，分别将其克隆至原核表达载体、真核表达载体，分别进行原核表达、真核表达和；其中，在原核表达的过程中，能得到稳定表达p72重组蛋白的大肠杆菌以及能得到纯化后的p72重组蛋白；经过真核表达后，能得到稳定表达p72重组蛋白的CHO细胞株。利用本发明专利技术的构建方法能在2个月内筛选获得表达非洲猪瘟病毒p72蛋白的CHO细胞株，并在没有嘌呤霉素筛选压力下，细胞系传至20代，仍可检测到外源重组蛋白，成功率为90％，具有试验周期短、成功率高和表达成本低的优点。表达成本低的优点。表达成本低的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种非洲猪瘟病毒p72蛋白稳定表达细胞系及其构建方法


[0001]本专利技术涉及重组蛋白表达的
，具体涉及一种非洲猪瘟病毒p72蛋白稳定表达细胞系及其构建方法。

技术介绍

[0002]非洲猪瘟(Infection with African swine fever virus)是由非洲猪瘟病毒 (African Swine fever virus)感染家猪和各种野猪(如非洲野猪、欧洲野猪等) 而引起的一种急性、出血性、烈性传染病。世界动物卫生组织将其列为法定报告动物疫病，该病也是我国重点防范的一类动物疫情。其特征是发病过程短，最急性和急性感染死亡率高达100％。
[0003]非洲猪瘟病毒外壳为二十面体衣壳，主要由病毒基因编码的蛋白P72组装而成。主要衣壳蛋白(MCP)P72是病毒的最主要的结构成分，约占病毒总质量的 31％～33％，使其成为感染猪的主要抗原之一。研究资料显示，识别P72的单克隆抗体可中和毒力强的ASFV分离株，p72蛋白相对比较保守，有稳定的抗原性，且与病毒进入宿主细胞的过程有关，针对p72的抗体能够抑制病毒与巨噬细胞的结合。因此，p72是一个很好的保护性抗原。
[0004]原核蛋白表达系统既是最常用的表达系统，也是最经济实惠的蛋白表达系统。原核蛋白表达系统以大肠杆菌表达系统为代表，具有遗传背景清楚、成本低、表达量高和表达产物分离纯化相对简单等优点。哺乳动物细胞表达系统主要优点是蛋白翻译后加工机制最接近体内的天然形式，最容易保留生物活性，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞被认为是最具代表性的哺乳动物细胞表达系统。相对于其他蛋白表达系统，该细胞易于形成工程细胞系，能稳定表达目的蛋白，有利于进行大规模生产。目前，已经有P72蛋白能成功的表达，但表达产量低，无法满足基因工程亚单位疫苗的开发。

技术实现思路

[0005]为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的之一在于提供一种非洲猪瘟病毒 p72蛋白稳定表达细胞系的构建方法，通过原核表达和真核表达的方法得到稳定表达p72重组蛋白的CHO细胞系以及得到纯度较高的p72重组蛋白；本专利技术的目的之二在于提供一种非洲猪瘟病毒p72蛋白稳定表达细胞系，稳定性强，活性高。
[0006]本专利技术的目的之一采用如下技术方案实现：
[0007]一种非洲猪瘟病毒p72蛋白稳定表达细胞系的构建方法，包括以下步骤：
[0008]1)构建载体：分析非洲猪瘟p72蛋白的基因序列的信号肽和酶切位点信息， p72蛋白的核苷酸序列如SEQ.ID NO：1所示；；在起始密码子ATG之前添加如 SEQ.ID NO:2所示Kozac序列，在序列N端连接如SEQ.ID NO:3所示的小鼠IgG κ链信号肽序列；再在肽链C端连接组氨酸标签，并以融合蛋白与目的蛋白相连接，再在融合蛋白的前端添加42个氨基酸，一是为了促进基因组复制，二是可作为纯化标签，后续用于检测和纯化，完成序列改造后的目的蛋白的核苷酸序列如SEQ.ID NO：4所示，将目的蛋白分别克隆至原核表达载体、真核表达
载体；
[0009]2)原核表达：将步骤1)的克隆完成后的原核表达载体转化至感受态大肠杆菌)中，挑取单克隆接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，进行培养；再将培养物接种到含卡那霉素的LB液体培养基中，继续培养；然后加入IPTG培养，离心收集沉淀，加入溶剂重新悬浮，在冰浴下进行超声，离心，分离沉淀与上清，对沉淀与上清分别检测p72重组蛋白是否表达，得到表达产物；
[0010]使用蛋白纯化仪对表达产物进行纯化，对层析柱进行平衡，随后进行上样，分别用含不同浓度的咪唑的对样品进行梯度洗脱，取纯化后的样品检测p72重组蛋白是否被纯化；
[0011]3)真核表达：将步骤1)的克隆完成后的真核表达载体以脂质体方式转染到经过培养的CHO细胞，放入二氧化碳培养箱中进行培养，通过荧光显微镜观察p72蛋白表达情况，并取培养后的细胞用细胞裂解液裂解，取细胞裂解后的溶液检测p72重组蛋白是否表达；
[0012]4)性能检测：将步骤2)所得的原核表达中超声后的沉淀重新悬浮，与步骤3)所得的真核表达的细胞裂解后的溶液，再与碱性物质进行混合，再铺至酶标板中进行包被，以含脱脂奶粉的PBST溶液进行孵育封闭，选用猪ASFV阳性血清作为第一抗体，兔抗猪HRP作为第二抗体对两种抗原进行检测，检验p72 重组蛋白与阳性血清中ASFV抗体的结合情况，得到非洲猪瘟病毒p72蛋白稳定表达细胞系。
[0013]进一步，步骤1)中，所述组氨酸标签体是由6～10个组氨酸成串的肽段；所述融合蛋白为含有2～6个四联体的柔性Linker；所述原核表达载体为pET
‑
26b (+)；所述真核表达载体为pCMV
‑
EGFP。
[0014]再进一步，步骤2)中，将步骤1)克隆完成后的原核表达载体转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3)中，挑取单克隆接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，以150～200rpm的转速下振荡培养过夜；将过夜培养物按1:100的比例接种到含卡那霉素的LB液体培养基中，以150～200rpm的转速下振荡培养4～5h 至OD
600
为0.3～0.6；加入IPTG使终浓度为0.3～0.6mM，在35～38℃振荡培养4～5h；在7000～8000rpm的转速下离心收集沉淀，用PBS溶液对沉淀重新悬浮，在 200～300W的冰浴超声(10s/10s)20～30min，再以8000～10000rpm的转速下进行离心，分离沉淀与上清，对沉淀与上清分别进行蛋白免疫印迹检测p72重组蛋白是否表达，得到表达产物。
[0015]进一步，步骤2)中，使用蛋白纯化仪对表达产物进行纯化，使用pH为7.0～7.5 的PB缓冲液对HisTrap层析柱进行平衡，随后进行上样，分别用pH为7.5～8.0 的含100mM、200mM、300mM、400mM、500mM咪唑的对样品进行梯度洗脱，取纯化后的样品进行蛋白免疫印迹检测p72重组蛋白是否被纯化。
[0016]再进一步，步骤3)中，所述CHO细胞的培养步骤为：使用含10％胎牛血清的F12
‑
K培养基在细胞瓶中复苏CHO细胞，按照1：3的比例进行传代，直到细胞量(0.2～7)
×
108个细胞；将新培养的CHO细胞以(0.5～2)
×
106个细胞的密度接种6孔细胞培养板，置于37℃二氧化碳培养箱培养18～24h。
[0017]进一步，步骤3)中，将克隆完成后的真核表达载体以脂质体方式转染到经过培养的CHO细胞，每孔转染DNA量为2～5μg，放入二氧化碳培养箱中，在 35～38℃下培养48～72h，通过荧光显微镜观察p72蛋白表达情况，并取培养48h、 72h的细胞用细胞裂解液裂解，取细胞裂解后的溶液进行蛋白免疫印迹检测p72 重组蛋白是否表达。
[0018]再进一步，步骤4)中，将步骤2)所得的原核表达中超声后的沉淀重新悬浮，与步骤3)所得的真核表达的细胞裂解本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种非洲猪瘟病毒p72蛋白稳定表达细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)构建载体：分析非洲猪瘟p72蛋白的基因序列的信号肽和酶切位点信息，p72蛋白的核苷酸序列如SEQ.ID NO：1所示；在起始密码子ATG之前添加如SEQ.ID NO:2所示Kozac序列，在序列N端连接如SEQ.ID NO:3所示的小鼠IgGκ链信号肽序列；再在肽链C端连接组氨酸标签，以融合蛋白与目的蛋白相连接，再在融合蛋白的前端添加纯化标签，完成序列改造后的目的蛋白的核苷酸序列如SEQ.ID NO：4所示，将目的蛋白分别克隆至原核表达载体、真核表达载体；2)原核表达：将步骤1)的克隆完成后的原核表达载体转化至感受态大肠杆菌中，挑取单克隆接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，进行培养；再将培养物接种到含卡那霉素的LB液体培养基中，继续培养；然后加入IPTG培养，离心收集沉淀，加入溶剂重新悬浮，在冰浴下进行超声，离心，分离沉淀与上清，对沉淀与上清分别检测p72重组蛋白是否表达，得到表达产物；使用蛋白纯化仪对表达产物进行纯化，对层析柱进行平衡，随后进行上样，分别用含不同浓度的咪唑的对样品进行梯度洗脱，取纯化后的样品检测p72重组蛋白是否被纯化；3)真核表达：将步骤1)的克隆完成后的真核表达载体以脂质体方式转染到经过培养的CHO细胞，放入二氧化碳培养箱中进行培养，通过荧光显微镜观察p72蛋白表达情况，并取培养后的细胞用细胞裂解液裂解，取细胞裂解后的溶液检测p72重组蛋白是否表达；4)性能检测：将步骤2)所得的原核表达中超声后的沉淀重新悬浮，与步骤3)所得的真核表达的细胞裂解后的溶液，再与碱性物质进行混合，再铺至酶标板中进行包被，以含脱脂奶粉的PBST溶液进行孵育封闭，选用猪ASFV阳性血清作为第一抗体，兔抗猪HRP作为第二抗体对两种抗原进行检测，检验p72重组蛋白与阳性血清中ASFV抗体的结合情况，得到非洲猪瘟病毒p72蛋白稳定表达细胞系。2.如权利要求1所述的非洲猪瘟病毒p72蛋白稳定表达细胞系的构建方法，其特征在于，步骤1)中，所述组氨酸标签体是由6～10个组氨酸成串的肽段；所述融合蛋白为含有2～6个四联体的柔性Linker；所述原核表达载体为pET
‑
26b(+)；所述真核表达载体为pCMV
‑
EGFP。3.如权利要求1所述的非洲猪瘟病毒p72蛋白稳定表达细胞系的构建方法，其特征在于，步骤2)中，将步骤1)克隆完成后的原核表达载体转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3)中，挑取单克隆接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，以150～200rpm的转速下振荡培养过夜；将过夜培养物按1:100的比例接种到含卡那霉素的LB液体培养基中，以150～200rpm的转速下振荡培养4～5h至OD
...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯夏宁，李作生，陈瑞爱，刘郁夫，容芳，郝文茜，王圳，
申请(专利权)人：岭南现代农业科学与技术广东省实验室肇庆分中心，
类型：发明
国别省市：