多型干扰素通路活化的多重定量检测方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了多型干扰素通路活化的检测的基因组及其对应的引物组，包括：扩增IFI44、MX1、IRF1以及GBP1基因的引物。将检测引物组结合内参基因HPRT1，开发了多重检测方法，可对病人样品中的基因同时进行精准定量分析，从而实现用一个反应就对I/II型干扰素通路进行分型，并具有较高的特异性和灵敏度。本发明专利技术开发的检测方法同时检测四个目标基因，经临床验证，其定量结果与四个基因分开来单独检测的结果高度吻合，在保证定量结果可靠性的同时大大提高检测效率。结合筛选到的基因的特异性和四重定量检测的可靠性，本发明专利技术能够精确的鉴别引发自身免疫性疾病的分子机制和评估病情的发展，为临床诊断和精准治疗提供有效的指导。临床诊断和精准治疗提供有效的指导。临床诊断和精准治疗提供有效的指导。

【技术实现步骤摘要】
多型干扰素通路活化的多重定量检测方法和试剂盒


[0001]本专利技术涉及精准检测领域，具体涉及多型干扰素通路活化的检测引物组及其应用。

技术介绍

[0002]干扰素是重要的免疫调节分子，其中包括I型(包括IFN
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α和IFN
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β)和II型(IFN
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γ)，在多种免疫系统参与的疾病中起着关键作用：在病毒感染的疾病中，干扰素应答构成了机体抵御病毒感染的第一道防线，可以调节几乎所有的固有和适应性免疫应答的效应细胞。在多个病毒感染引起的疾病中，如艾滋病、肝炎等，干扰素可用于激活自身免疫反应，帮助清除病毒。在包括由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS
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CoV
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2)引起的疾病在内的各种疾病中，干扰素可用于监测疾病发生发展及预后评估。
[0003]在癌症中，干扰素通常起着促进抗肿瘤免疫反应的有益作用，同时也被用来评估免疫系统的活性，对药物的反应和疗效预测等等。在脓毒症，COVID
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19等病症中，病人的死因往往是炎症风暴引起的器官衰竭。而这其中IFN
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γ是诱导细胞凋亡的关键细胞因子，其大规模过度表达被认为是导致免疫系统过分激活，引起免疫风暴的主要原因，最终导致器官衰竭。在系统性红斑狼疮(SLE)、皮肌炎、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病的发生发展中，干扰素相关通路的异常活化起着关键作用。在不同自身免疫性疾病中，干扰素通路活化的类型和程度不同，例如SLE中存在I型干扰素通路的异常活化。目前，自身免疫病治疗的主要手段还是用激素、免疫抑制剂等药物抑制身体的免疫反应。然而，这些药物并不能解决发病的根本原因，且长期用药有严重的副作用。目前国外已有针对不同干扰素通路的靶向药物获批或进入临床末期，用于治疗自身免疫性疾病。因此，对患者的干扰素活化的通路进行鉴定和分型是未来的发展方向，能够精确的指导用药，实现更精准有效、副作用更低的治疗。同时，对干扰素通路活化的程度进行定量分析，能够实现对自身免疫性疾病病人更有效的诊断，对病情发展做出更准确的评估。然而，目前市场上还缺少相应的诊断产品。
[0004]对干扰素通路的活化状况进行定量分析能帮助多种疾病实现有效的病情分析，预后评估，用药指导，疗效监测等等。目前临床上对包括自身免疫性疾病在内的这类疾病的诊断主要依靠临床症状和表现，高度依赖于医生的临床经验并难以实现准确的定量评估。血液中产生的特定抗体也常被用来辅助诊断，但这些抗体与病情发展存在脱节，往往病人症状已经缓解而抗体依然存在。对干扰素本身的直接检测是目前正在大力发展的临床诊断技术。干扰素在血液中含量很低，它们的微小波动就会产生很大效应，造成检测困难，且难以直接用于病情评估。另一方面，干扰素依靠与免疫细胞上的受体结合并激活细胞内相关通路来实现其作用；这些通路的激活会造成免疫细胞(如PBMC，外周血单个核细胞)中一系列下游ISG基因(IFN
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stimulated genes，干扰素诱导基因)的激活和表达上调；对这些基因表达的监测，是更直接的评估干扰素通路活化状况的手段。
[0005]另一方面，文献中报导较多的是I型干扰素激活相关的特征基因，并且用来测量I型干扰素通路的活化。II型干扰素相关基因也有报导，然而这些基因存在的问题包括：本身
表达量低，检测困难；由II型干扰素通路活化引起的表达变化太小，难以对通路活化进行鉴定和定量；特异性差，同时也能被I型干扰素激活。市面上没有能够可靠、特异、定量检测II型干扰素通路活化的方法或产品。
[0006]目前在分子层面检测干扰素通路活化的方法包括针对蛋白的酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)以及针对基因表达的转录组分析(RNA
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sequencing和微阵列芯片(microarray))和定量逆转录聚合酶链式反应(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，即RT
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qPCR)等。
[0007]RNA
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sequencing和Microarray具有数据量大，覆盖基因组范围广，数据的灵活度高，并能用于基因组结构分析的强大优势。但较ELISA和RT
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PCR相比，转录组分析的价格过高，所耗时间过长，地区覆盖范围不广。
[0008]同时，I型干扰素在血浆中难以测量，使得ELISA技术通常无法充分发挥作用。血浆蛋白水平的检测存在着以下几个缺陷：1)包括干扰素在内的大多数细胞因子在其作用部位附近产生，不一定会释放到血液循环中；2)干扰素分子，尤其是IFN
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γ本身的血清浓度通常非常低且难以检测。大部分SLE患者中存在抗IFN
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α的抗体，该抗体可以中和IFN
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α的生物活性；3)某些情况下，干扰素的网络交互作用导致ISG在没有胞外直接IFN刺激/较低浓度刺激下也能持续表达；4)在应用IFN受体相关单抗时，直接检测血清中IFN水平不能反映下游通路活化情况。
[0009]RT
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qPCR技术是对基因表达进行定量分析的通用方法，首先将基因表达的产物RNA逆转录成为DNA，再对DNA用荧光定量PCR技术进行扩增和定量检测。PCR是一种常用分子生物学技术，可用于将微量目标核酸序列(例如待测基因序列)扩增至可检测的量。其原理是利用能识别目标序列的DNA引物与目标特异性结合，并在DNA聚合酶的作用下对目标序列进行指数级复制和扩增。在分子诊断中常用的荧光定量PCR则在普通PCR的基础上引入荧光标记的探针，利用在扩增过程中产生的荧光信号对目标序列进行实时检测和定量。在多重定量PCR技术中，针对不同的靶标采用各自特异的荧光探针并携带不同颜色的荧光标记，使得多个靶标可以被同时检测。
[0010]目前较多的是I型干扰素相关基因的检测，并且往往一次只能检测一个基因的表达，也就是单重检测。多个目标基因需要多个反应来检测，造成消耗的人力物力成倍的增长，而一次能检测的样品数量(检测通量)成倍的下降。多重RT
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qPCR技术可以解决这个问题，在一个反应里同时检测多个目标基因的表达。另一方面，多重检测技术能实现更准确的定量。在多个基因靶标中可以包括一个通常在细胞内表达很稳定的内参基因，这样待测基因相对于内参基因表达的比例就能准确反映出待测基因在细胞内的表达变化。而且这种相对表达量不会随着反应中核酸样品的总量多少而变化，使得检测结果受细胞处理，核酸提取以及加样多少的影响极小，保证了每次结果的可重复性。尽管如此，多重RT
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qPCR的设计有相当难度，随着目标基因的增加，多个基因所需要的引物(primer)探针之间越容易互相干扰互相竞争，给各个基因的定量带来较大误差，严重影响临床结果的可靠性。
[0011]另一方面，文献中报导的跟II型干扰素通路活化相本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.多型干扰素通路活化的检测的基因组及其对应的引物组，包括：1)扩增IFI44基因的引物；和2)任选的扩增MX1基因的引物、扩增IRF1基因的引物以及扩增GBP1基因的引物；其特征在于，扩增IFI44基因的引物序列分别如SEQ ID NO:1
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2所示，扩增MX1基因的引物分别如SEQ ID NO:4
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5所示，扩增IRF1基因的引物分别如SEQ ID NO:7
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8所示，扩增GBP1基因的引物分别如SEQ ID NO:17
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18所示。2.根据权利要求1所述的检测引物组，其特征在于，所述引物组包括：1)扩增IFI44基因的引物；和2)扩增MX1基因的引物和扩增IRF1基因的引物；或，扩增IRF1基因的引物和扩增GBP1基因的引物。3.根据权利要求1
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2任一所述的检测引物组，其特征在于，还包括探针，所述结合IFI44基因的探针如SEQ ID NO:3所示，所述结合MX1基因的探针如SEQ ID NO:6所示，所述结合IRF1基因的探针如SEQ ID NO:9所示，所述结合GBP1基因的探针如SEQ ID NO:19所示。4.根据权利要求3所述的引物组，其特征在于，所述探针采用荧光基团标记。5.根据权利要求4所述的引物组，其特征在于，还包括扩增内参基因的引物，优选地，所述内参基因为HPRT1基因，所述扩增内参基因的引物序列分别如SEQ ID NO:10
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11所示。6.根据权利要5所述的引物组，其特征在于，还包括结合内参基因HPRT1的探针，优选地，所述结合内参基因HPRT1的探针序列如SEQ ID NO:12所示...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹泽晖，扶琼，谭蔚泓，吕良敬，钱金晶，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属仁济医院，
类型：发明
国别省市：