一种抗腺相关病毒中和抗体的检测方法技术

本发明专利技术属于生物分析领域，涉及一种抗腺相关病毒中和抗体的快速检测方法。腺相关病毒AAV是一种非常有前景的基因治疗递送载体，而在非人灵长类和人类中预存的抗AAV中和抗体将会带来安全和疗效方面的不利影响。本发明专利技术通过多种条件优化，开发了一种快速灵敏地检测预存AAV中和抗体的方法，为该类产品的开发提供重要的参考价值。要的参考价值。要的参考价值。

【技术实现步骤摘要】
一种抗腺相关病毒中和抗体的检测方法


[0001]本专利技术属于生物分析领域，涉及一种抗腺相关病毒中和抗体的检测方法。

技术介绍

[0002]腺相关病毒（Adeno
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Associated Virus，AAV）是微小病毒科（parvoviridae）家族成员之一，是一类无法自主复制、无被膜的二十面体微小病毒，其直径约 20
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26nm，含有4.7kb左右的线状单链DNA作为基因组。在非致病的野生型AAV基础上改造而成的重组AAV，携带用于疾病治疗的目的基因片段，具有种类多样、免疫原性极低、安全性高、宿主细胞范围广、扩散能力强、体内长期表达等特点，为通过基因治疗策略治疗疾病带来了希望。美国食品药品管理局FDA于2017年批准了Luxturna，用于治疗REP65 基因突变引起的遗传进行性视网膜疾病；并于2019年批准了Zolgensma，用于治疗脊髓性肌萎缩症SMA。基因治疗行业对使用AAV递送载体的兴趣持续增长，目前已有近300项使用AAV载体的临床试验开展，所涉及的适应症包括血友病、α
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1抗胰蛋白酶缺乏症、杜氏肌营养不良、庞贝病、年龄相关黄斑变性、先天性耳聋、阿尔茨海默氏症等。
[0003]随着AAV载体的广泛应用，越来越多的研究需要在临床前动物模型中评估其治疗方法的安全性和药效，其中最重要的是使用非人灵长类动物（Nonhuman primate，NHP），如食蟹猴（Cynomolgus macaque）和恒河猴（rhesus macaques）。许多研究已经发现人类中存在针对各种AAV血清型的预存抗体，进而影响使用AAV载体进行治疗的效果甚至引起严重的免疫反应。在NHP中进行的研究也发现了类似的局限性。因此对于受试者不同血清型AAV预存抗体的筛查是AAV基因治疗中至关重要的步骤。
[0004]目前对于AAV预存抗体的筛查没有统一方法。Uma Kavita等用一种基于化学发光的竞争性ELISA方法检测抗AAV9总抗体，该方法的灵敏度高，但是需要配置昂贵的仪器，对具有中和活性的抗体筛查提示作用有限。Ping Guo等报道了一种基于细胞结合和qPCR快速检测抗AAV2和AAV8中和抗体的方法，该方法可以快速检测AAV中和抗体，但是仅能反映部分中和活性，而且样本需要经过较为复杂的提取处理，才能进行qPCR分析。基于报告基因载体在体外感染细胞表达的方法被越来越多的实验室采用，然而现有报道的cell
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based assay实验周期需要4
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5天，不同实验采用的细胞和报告基因各不相同，细胞感染的程序也存在很大差异，并且由于AAV的感染能力可能受到生物基质中未知成分的干扰，因而对AAV中和抗体检测方法的灵敏度和专属性提出了较大的挑战。通过筛选敏感细胞株和报告基因，优化细胞感染条件和样本稀释条件，本专利技术提供了一种抗AAV中和抗体的快速检测方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了一种抗AAV中和抗体的快速检测方法，本检测方法基于AAV在体外感染敏感细胞后报告基因的表达，可以判断待测样本中是否存在AAV中和抗体及抗体滴度，为非临床和临床研究受试者的筛查提供参考。
[0006]本专利技术中所选择的敏感细胞株可以是贴壁细胞，也可以是悬浮细胞，包括但不限
于Hela细胞、HEK293T细胞、Huh7细胞、ARPE
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19细胞和CHO细胞等。
[0007]优选地，敏感细胞株为Hela细胞，P8
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P20代次，细胞活率不低于90%。
[0008]优选地，敏感细胞株为HEK293T细胞，P7
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P25代次，细胞活率不低于90%。
[0009]优选地，敏感细胞株为ARPE
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19细胞，P10
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P20代次，细胞活率不低于90%。
[0010]本专利技术使用携带报告基因的AAV感染敏感细胞株。所使用的报告基因包括但不限于绿色荧光蛋白基因（GFP）、荧光素酶基因（Luciferase，Luc）和β
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半乳糖苷酶基因（LacZ）等。所选择的AAV血清型包括但不限于AAV1、AAV2、AAV2.7m8、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9、AAVAnc80和AAV PHP.eB。
[0011]优选地，使用三质粒瞬时共转染HEK293T细胞包装AAV，经细胞裂解，核酸酶消化，碘克沙醇梯度密度离心，超滤换液，制备携带报告基因的AAV载体。
[0012]进一步地，使用的报告基因为GFP和Luc，AAV血清型为AAV1、AAV2和AAV8。
[0013]优选地，使用AAV2
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GFP和AAV8
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GFP分别感染Hela细胞、HEK293T细胞和ARPE
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19细胞，采用的病毒感染复数MOI（multiplicity of infection）分别为1E3、1E4、1E5和1E6，细胞感染后培养3天检测。
[0014]优选地，使用AAV1
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Luc和AAV8
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Luc分别感染HEK293T细胞，采用的病毒感染复数MOI为1E3至1E6，细胞感染后培养1天检测。
[0015]本专利技术通过对报告基因表达产物的检测，反映AAV体外转导能力的变化，所用的方法包括但不限于荧光显微镜观察、流式细胞术计数、荧光底物发光检测、酶促反应、ELISA和Western blot等。
[0016]优选地，使用荧光显微镜观察贴壁细胞中GFP的表达。使用475 nm左右的蓝光激发，GFP可在508nm处自行发射绿色荧光，在荧光显微镜下直接观察。
[0017]优选地，使用流式细胞仪检测悬浮细胞中GFP阳性细胞的比例。使用FITC通道进行检测，GFP受到488 nm左右的激光激发会释放出荧光，通过检测侧向散射的荧光强度经过信号放大可以得到样本的荧光情况，进而计算GFP阳性细胞的比例。
[0018]优选地，使用荧光素酶检测系统检测luciferase的表达。该检测系统底物溶液中含有裂解液和荧光素，将底物溶液直接加入细胞培养液中，裂解液裂解细胞并释放luciferase，luciferase催化荧光素发出自发荧光，使用带有荧光功能的酶标仪读取luminescence信号。
[0019]本专利技术用于临床前和临床生物样本中抗AAV中和抗体的检测，生物样本的类型包括但不限于血清、血浆、房水和玻璃体等。生物样本中基质成分较为复杂，本专利技术通过一定程度的稀释，消除基质非特异性干扰，确保检测结果准确可靠。
[0020]优选地，使用DMEM无血清培养基对血清样本进行10倍稀释。
[0021]进一步地，先使用AAV中和抗体阴性的空白血清对血清样本进行2倍至64倍稀释，然后用DMEM无血清培养基对稀释的血清样本再进行10倍稀释。
[0022]有益效果：通过本项目的优化能够实现临床前和临床生物样本中抗AA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速检测抗AAV中和抗体的方法： 其特征在于基于报告基因AAV体外感染敏感细胞系，经过方法优化，快速灵敏地筛查预存中和抗体，包含敏感细胞系的选择、报告基因的选择、病毒感染条件的优化和样本稀释的优化。2.如权利要求1中所述，敏感细胞系是Hela细胞、HEK293T细胞或ARPE
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19细胞。3.如权利要求1中所述，报告基因是GFP基因或luciferase基因。4.如权利要求1中所述，用无血清培养基配制病毒液，按照50μL体积加入96孔细胞培养板中感染细胞。5.如权利要求4中所述，96孔细胞培养板中每孔接种2E4或3E4细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：ꢀ五一IntClG零一N三三五六九，
申请(专利权)人：上海鼎新基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：