一种胆绿素还原酶突变体及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种胆绿素还原酶突变体及其编码基因和应用。所述的胆绿素还原酶突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比，在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第151位、第226位、第228位进行单点突变。所述的胆绿素还原酶突变体可用于胆红素的合成制备，将其作为生物催化剂转化底物胆绿素生成胆红素，反应后产物经验证，反应转化率>95％。本发明专利技术构建的胆绿素还原酶突变体与野生型酶相比，催化活性显著提高，能显著降低酶的使用量，有利于实现生产成本下降及利润提高，进而有效提高胆绿素还原酶在工业上的应用价值。素还原酶在工业上的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种胆绿素还原酶突变体及其编码基因和应用


[0001]本专利技术涉及生物酶工程
，具体涉及一种胆绿素还原酶突变体及其编码基因和应用。

技术介绍

[0002]胆红素(bilirubin，CAS号635
‑
65
‑
4)是一种胆色素，主要由血红素(heme，CAS号14875
‑
96
‑
8)降解产生。胆红素是牛黄的主要成分之一，牛黄是珍稀名贵中药材，具有极高的药用价值，在我国药用已有二千多年历史，是世界上公认的珍贵稀有药料。以牛黄配制的中成药方有180多个品种，如日本的救心丹、我国的安宫牛黄丸等。但是天然牛黄来源稀少，为了缓解天然牛黄药源短缺，我国药学工作者在上个世纪70年代根据天然牛黄的成分，成功地研制出人工牛黄。但是，人工牛黄粉胆红素含量太低(仅0.7％)，远远低于天然牛黄35％的含量标准，效果自然也存在差异，因此提高胆红素的含量和纯度有利于提高人工牛黄的品质。此外，胆红素也是药典记载的100多种中成药制剂的主要成份，具有镇静、镇惊、解热、降压等作用。
[0003]目前，胆红素基本都是从动物胆汁中提取，但胆汁中天然胆红素含量相当低，如猪胆汁中的胆红素含量仅为0.05％左右，由于原料来源受到限制，所以国内开发活猪造瘘引流胆汁的技术，该技术虽然解决了胆汁来源的问题，但是涉及的动物伦理问题引起很大的社会争议，因此该应用受到限制，开发非动物胆汁来源的胆红素生产方法具有重要经济价值和社会意义。
[0004]胆绿素还原酶(biliverdin reductase，简称BvdR，EC 1.3.1.24)是在血红素代谢中，催化胆绿素还原生成胆红素的酶，因此胆绿素还原酶可用于生物转化胆绿素制备胆红素。胆绿素还原酶可通过从动物肝脏直接提取的方法获得，但这种方法制备的胆绿素还原酶成本高，且活性不够理想，限制了其在胆红素工业化生产中的应用。因此，采用基因工程的方法制备胆绿素还原酶是当前经济有效的办法之一。
[0005]例如中国专利CN113186235A公开了一种生物转化法合成胆红素的方法，是以表达胆绿素还原酶的基因重组大肠杆菌细胞为生物催化剂，以胆绿素为底物生物转化合成胆红素。富含胆红素的大肠杆菌菌体作为胆红素提取的原料，克服了从动物胆汁中提取胆红素原料来源不足的问题。
[0006]蛋白质三维结构模拟和蛋白定向进化技术，是近年来发展起来的对原始基因序列进行人工改造、以满足工业化应用需求的高科技技术，其中蛋白定向进化技术更是获得了2018年诺贝尔化学奖。因此结合蛋白质三维结构模拟和蛋白定向进化技术，进一步寻找和开发新的具有更高酶活性、适用于工业大规模生产的胆绿素还原酶是目前研究的方向之一。

技术实现思路

[0007]针对现有技术存在的不足，本专利技术要解决的技术问题是提供一种胆绿素还原酶突
变体，以解决现有胆绿素还原酶活性不理想，难以实现工业化生产的问题。本专利技术利用生物信息分析胆绿素还原酶的三维结构，模拟分子间对接相互作用，找出酶蛋白的活性或特性具有关键性的氨基酸，并针对这些特定氨基酸进行定向突变来提高酶活性，将有利于实现生产成本下降及利润提高，进而有效提高胆绿素还原酶在工业上的应用价值。
[0008]为解决上述技术问题，本专利技术提供以下技术方案：
[0009]本专利技术提供的胆绿素还原酶突变体来源于Rattus norvegicus(Norway rat)的野生型胆绿素还原酶bvr。bvr的编码基因核苷酸序列通过常州基宇生物技术有限公司全基因合成所得，依据NCBI上提供的bvr基因序列经大肠杆菌偏好密码子优化，并在编码区两端分别添加NdeI和HindIII限制性内切酶位点，优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。该基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。合成的DNA片段通过限制性内切酶NdeI和HindIII酶切后，与经过同样双酶切的pET28a(+)载体(Novagen公司)进行连接、转化和筛选，筛选得到的阳性质粒bvr
‑
pET28a(+)转入BL21(DE3)宿主菌中，从而构建bvr的体外异源表达体系。
[0010]bvr的突变体的构建，是通过定向进化的技术手段得到的。具体地，通过分析bvr的三维蛋白质结构，利用能量最低原理和分子对接技术预测出可能的与催化相关的一个或多个位点，然后对这些位点进行饱和突变，从中筛选出活性有显著提高的突变体。
[0011]更为具体的过程如下：本专利技术通过自由能计算预测出的可能与催化和底物结合相关的位点为151、226和228。分别对这三个位点进行bvr饱和突变，利用紫外分光光度计来进行突变体的筛选。更为具体的为：当位点151的苯丙氨酸(F)突变为色氨酸(W)时，突变体酶活得到了提高；当位点226的精氨酸(R)突变为色氨酸(W)时，突变体酶活相对野生型酶来说得到了提高；当位点228的缬氨酸(V)突变为色氨酸(W)时，突变体酶活得到了显著提高。
[0012]因此，一方面，本专利技术请求保护一种胆绿素还原酶突变体，其氨基酸序列与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比，在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第151位、第226位、第228位进行单点突变。
[0013]具体地，所述的单点突变为：
[0014]当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第151位由苯丙氨酸突变为色氨酸，所述的胆绿素还原酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；
[0015]或，当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第226位由精氨酸突变为色氨酸，所述的胆绿素还原酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；
[0016]或，当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第228位由缬氨酸突变为色氨酸，所述的胆绿素还原酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
[0017]另一方面，本专利技术还请求保护上述胆绿素还原酶突变体的编码基因。
[0018]具体地，氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的胆绿素还原酶突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
[0019]或，氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的胆绿素还原酶突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
[0020]或，氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的胆绿素还原酶突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
[0021]根据现有公共知识，任何基因经操作或者改造后连入各类表达载体，转化至合适
宿主细胞，经适当条件诱导均能过量表达目的蛋白。
[0022]因此，又一方面，本专利技术还请求保护含有上述编码基因的载体。
[0023]具体地，所述的载体可以为各种表达载体，包括但不限于pET表达载体、pCW表达载体、pUC表达载体或pPIC9k表达载体中的任意一种表达载体。
[0024]又一方面，本专利技术还请求保护含有上述编码基因的宿主细胞。
[00本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种胆绿素还原酶突变体，其特征在于，所述的胆绿素还原酶突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比，在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第151位、第226位、第228位进行单点突变。2.根据权利要求1所述的胆绿素还原酶突变体，其特征在于，所述的单点突变为：当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第151位由苯丙氨酸突变为色氨酸，所述的胆绿素还原酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；或，当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第226位由精氨酸突变为色氨酸，所述的胆绿素还原酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；或，当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第228位由缬氨酸突变为色氨酸，所述的胆绿素还原酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。3.权利要求1或2所述的胆绿素还原酶突变体的编码基因，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的胆绿素还原酶突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；或，氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的胆绿素还原酶突变体的编码基因的核苷酸序列如...

【专利技术属性】
技术研发人员：余允东，周嘉莹，戴维，何家洛，
申请(专利权)人：中山俊凯生物技术开发有限公司，
类型：发明
国别省市：