基于罗伊氏乳杆菌的CRISPR多基因编辑方法技术

本发明专利技术公开了基于罗伊氏乳杆菌的CRISPR多基因编辑方法，属于基因工程技术领域。本发明专利技术通过在大肠杆菌

【技术实现步骤摘要】
基于罗伊氏乳杆菌的CRISPR多基因编辑方法


[0001]本专利技术涉及基因工程
，特别涉及基于罗伊氏乳杆菌的CRISPR多基因编辑方法，具体的本专利技术通过利用CRISPR系统，构建基于罗伊氏乳杆菌的多基因编辑质粒、将质粒电转化到罗伊氏乳杆菌的感受态细胞中的应用技术，提高了罗伊氏乳杆菌基因编辑效率，在技术上首次实现了对罗伊氏乳杆菌的无痕基因整合，特别适用于罗伊氏乳杆菌的连续基因编辑。

技术介绍

[0002]罗伊氏乳杆菌是异源发酵乳酸菌，属于革兰氏阳性兼性厌氧菌，在显微镜下呈末端圆形的略微不规则的弯曲杆菌，被发现广泛存在于人类和其他动物的肠道中。罗伊氏乳杆菌自1962年首次被分离出来，就受到广泛的关注，因为它是为数不多的能够在人体的肠胃中生存的细菌，耐受胃酸和胆盐，已被证明是人类胃肠道的常驻菌。罗伊氏乳杆菌主要定植在小肠上部的粘膜上，是新生儿及健康成年人肠道微生物菌群的主要成员。
[0003]罗伊氏乳杆菌对宿主健康的影响被广泛研究，主要是通过在宿主的胃肠道中定植，代谢生成一些抗菌物质和短链脂肪酸来发挥其益生功能。罗伊氏乳杆菌通过参与色氨酸代谢通路，增加肠道中吲哚衍生物及短链脂肪酸的含量，在宿主肠道中发挥免疫调节的功能；罗伊氏乳杆代谢产生的罗伊氏菌素具有广谱抗菌的能力，对肠道许多致病菌有明显的抑制作用；另外，其代谢合成的罗伊氏素还可以改变肠道肿瘤细胞附近的氧化还原平衡，抑制肿瘤的生长。
[0004]目前对罗伊氏乳杆菌的研究及应用多为菌体及其代谢产物的直接利用，关于罗伊氏乳杆菌的遗传体系的研究很少，国内外目前对罗伊氏乳杆菌的遗传操作是通过传统的同源重组来进行遗传改造，随着研究的不断深入，研究人员不断对其遗传操作的技术进行优化，比如利用recT介导高效的同源重组，或者是利用CRISPR
‑
Cas9作为反筛工具来高效的筛选得到遗传改造过的菌株，但是只能在罗伊氏乳杆菌中只能进行基因的敲除和点突变，无法无痕的整合基因，因此很大程度的限制了对罗伊氏乳杆菌相关益生机制的研究及对该菌的益生性能的应用。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供基于罗伊氏乳杆菌的CRISPR多基因编辑方法，以解决上述现有技术存在的问题，通过利用罗伊氏乳杆菌的CRISPR系统，一次就可以实现多个基因的编辑，为获得在宿主肠道中益生性能更优良的目的菌株奠定基础。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0007]本专利技术提供一种基于罗伊氏乳杆菌的基因编辑质粒，包括：两个或者两个以上的重复序列、含有两个三型内切酶酶切位点的mini
‑
CRISPR序列以及罗伊氏乳杆菌的穿梭质粒；
[0008]其中，每相邻的两个所述重复序列间插入所述mini
‑
CRISPR序列，之后再与所述穿
梭质粒连接，即得基于罗伊氏乳杆菌的基因编辑质粒。
[0009]优选的是，所述重复序列如SEQ ID NO：1所示。
[0010]SEQ ID NO：1如下所示：GTTTTAGATGTACTTCAAATCAATAATGTTTAGAAC。
[0011]优选的是，所述mini
‑
CRISPR序列如SEQ ID NO：2所示。
[0012]SEQ ID NO：2如下所示：
[0013]GTTTTAGATGTACTTCAAATCAATAATGTTTAGAACAGAGACCGACGTCGGTCTCAGTTTTAGATGTACTTCAAATCAATAATGTTTAGAAC。
[0014]本专利技术还提供所述的基因编辑质粒的构建方法，包括以下步骤：
[0015](1)在所述重复序列间插入所述mini
‑
CRISPR序列后，将其与所述穿梭质粒分别进行酶切，酶切后，进行酶连接；
[0016](2)酶连接后转入大肠杆菌培养，经筛选，得到阳性转化子；
[0017](3)活化所述阳性转化子，进行质粒抽提，即得基因编辑质粒。
[0018]优选的是，步骤(1)中，所述酶切的位点为Sac1、Xba1；
[0019]步骤(2)中，所述筛选条件为含有氯霉素抗性的LB固体培养基，37℃过夜培养，挑取阳性转化子。
[0020]本专利技术还提供一种基于所述的基因编辑质粒对罗伊氏乳杆菌进行多基因敲除的方法，包括以下步骤：
[0021](1)根据罗伊氏乳杆菌胞内CRISPR系统的PAM为3
’
端NGG设计所要敲除的n个基因的spacer，并根据所要敲除的n个基因的上下游序列分别设计同源臂，将同源臂克隆至所述基因编辑质粒，构建n个基因的敲除质粒；
[0022](2)利用电转化，将n个基因的敲除质粒转入罗伊氏乳杆菌感受态细胞中，经筛选，挑取单菌落并进行PCR验证，得到n个基因的敲除突变株；其中，n为自然数，且n≥1。
[0023]本专利技术还提供一种基于所述的基因编辑质粒对罗伊氏乳杆菌进行基因插入的方法，包括以下步骤：
[0024](1)根据罗伊氏乳杆菌胞内CRISPR系统的PAM为3
’
端NGG以及拟插入位点设计spacer，并根据所述拟插入位点的上下游设计同源臂，将两个所述同源臂和拟插入基因克隆至所述基因编辑质粒，构建插入质粒；
[0025](2)将所述插入质粒电转至罗伊氏乳杆菌感受态细胞，经筛选，挑取单菌落并进行PCR验证，得到基因插入突变株。
[0026]本专利技术还提供一种基于所述的基因编辑质粒对罗伊氏乳杆菌进行基因点突变的方法，包括以下步骤：
[0027](1)根据罗伊氏乳杆菌胞内的CRISPR系统的PAM为3
’
端NGG及拟突变位点设计spacer，并根据所述拟突变位点的上下游序列设计同源臂，突变位点设计在扩增的同源臂的引物上，将两个所述带有突变位点的同源臂克隆至所述基因编辑质粒，构建突变质粒；
[0028](2)将所述突变质粒电转至罗伊氏乳杆菌感受态细胞，经筛选，挑取单菌落并进行PCR验证，得到点突变菌株。
[0029]优选的是，还包括对含有编辑质粒却未成功发生基因编辑的罗伊氏杆菌进行处理，以获得成功发生基因编辑菌株的步骤；所述处理方法为：经过PCR验证未发生编辑的罗伊氏乳杆菌，通过在氯霉素抗性筛选条件下，传代1
‑
2代，即可获得成功发生编辑的罗伊氏
乳杆菌。
[0030]本专利技术还提供一种利用所述的基因编辑质粒对完成基因编辑的罗伊氏乳杆菌的反筛方法，将按照所述的方法完成的基因编辑的罗伊氏乳杆菌基因突变株，在不含抗生素的MRS固体培养基上划线培养，经过1
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2代传代培养，挑取单菌落进行PCR验证，筛选得到质粒丢失的目的菌株。
[0031]本专利技术公开了以下技术效果：
[0032]本专利技术以大肠杆菌和罗伊氏乳杆菌穿梭质粒pC2为基础，根据所要敲除的基因的数量及序列设计miniCRISPR序列，克隆至所述穿梭质粒pC2，构建基于罗伊本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于罗伊氏乳杆菌的基因编辑质粒，其特征在于，包括：两个或者两个以上的重复序列、含有两个三型内切酶酶切位点的mini
‑
CRISPR序列以及罗伊氏乳杆菌的穿梭质粒；其中，每相邻的两个所述重复序列间插入所述mini
‑
CRISPR序列，之后再与所述穿梭质粒连接，即得基于罗伊氏乳杆菌的基因编辑质粒。2.如权利要求1所述的基因编辑质粒，其特征在于，所述重复序列如SEQ ID NO：1所示。3.如权利要求1所述的基因编辑质粒，其特征在于，所述mini
‑
CRISPR序列如SEQ ID NO：2所示。4.如权利要求1
‑
3任一项所述的基因编辑质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)在所述重复序列间插入所述mini
‑
CRISPR序列后，将其与所述穿梭质粒分别进行酶切，酶切后，进行酶连接；(2)酶连接后转入大肠杆菌培养，经筛选，得到阳性转化子；(3)活化所述阳性转化子，进行质粒抽提，即得基因编辑质粒。5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述酶切的位点为Sac1、Xba1；步骤(2)中，所述筛选条件为含有氯霉素抗性的LB固体培养基，37℃过夜培养，挑取阳性转化子。6.一种基于权利要求1所述的基因编辑质粒对罗伊氏乳杆菌进行多基因敲除的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)根据罗伊氏乳杆菌胞内CRISPR系统的PAM为3
’
端NGG设计所要敲除的n个基因的spacer，并根据所要敲除的n个基因的上下游序列分别设计同源臂，将同源臂克隆至所述基因编辑质粒，构建n个基因的敲除质粒；(2)利用电转化，将n个基因的敲除质粒转入罗伊氏乳杆菌感受态细胞中，经筛选，挑取单菌落并进行PCR验证，得到n个基因的敲除突变株；其中，n为自然数，且n≥...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭楠，郭秋瑾，晏逸婷，隋欣，张贞婷，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：