一种直接RNA测序建库方法技术

本发明专利技术涉及一种直接RNA测序建库方法，包括PolyA

【技术实现步骤摘要】
一种直接RNA测序建库方法


[0001]本专利技术涉及基因测序
，具体是指一种直接RNA测序建库方法。

技术介绍

[0002]常规的基于ONT测序平台的RNA直接测序，采用SQK
‑
RNA002建库试剂盒，按照图1所示的操作流程完成建库。
[0003]具体步骤如下：
[0004]1.RNA用量：总体积9μL、总量500ng；
[0005]2.准备PCR反应体系，包括NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer 3.0μL、RNA 9.0μL、RNA CS(RCS).110nM 0.5μL、RT Adapter(RTA) 1.0μL、T4 DNA ligase 1.5μL，混匀所有组分后迅速离心，在室温孵育10分钟；
[0006]3.准备反转录反应体系，包括：无核酸酶水9.0μL、10mM dNTPs 2.0μL、5x first
‑
strand buffer 8.0μL、0.1M DTT 4.0μL；
[0007]4.将第3步的混合液加入到第2步的反应体系中，混匀；
[0008]5.加入2μL的Super Script III reverse transcriptase至上述反应体系，混匀；
[0009]6.设置PCR扩增程序，分别在50℃50分钟，70℃10分钟，4℃保存并进行PCR扩增；
[0010]7.将步骤6中的PCR产物转移至1.5mL无菌离心管中；
[0011]8.涡旋震荡重悬Agencourt RNA Clean XP beads，取72μL加入第6步的溶液中，移液器混匀后在Hula mixer中室温孵育5分钟；
[0012]9.将样品管置于磁力架上，静止，吸除上清液，用150μL的70％乙醇清洗磁珠，最后用移液器吸除70％乙醇；
[0013]10.从磁力架上取下离心管，用20μL无核酸酶水重悬磁珠，室温孵育5分钟；
[0014]11.将上述洗脱液转移至1.5ml无菌离心管中，配制adapter连接反应体系，包括第10步的RNA溶液20.0μL、NEB Next Quick Ligation Reaction Buffer 8.0μL、RNA Adapter(RMX) 6.0μL、无核酸酶水3.0μL、T4 DNA Ligase 3.0μL、T4 DNA Ligase 3.0μL，混匀各组分，室温孵育10分钟；
[0015]12.加入40μL RNA Clean XP beads至步骤11中的接头连接反应体系中，混匀后在Hula mixer中室温孵育5分钟；
[0016]13.将样品管置于磁力架上，吸除上清液，加入150μL的wash buffer(WSB)清洗磁珠，去除上清液。重复清洗一次；
[0017]14.加入21μL洗脱缓冲液(EB)重悬磁珠，室温孵育10分钟。吸取上清液至1.5mL无菌离心管中，取1μL进行核酸浓度检测，完成建库。
[0018]以上建库方法缺点：此方法仅能对含有poly A尾的RNA进行建库；每张测序芯片只能进行一个文库的测序。
Column中，室温离心1分钟，弃去收集管中的液体，
[0046]s、加入400μL的RNA prep buffer至吸附柱中，室温12000g离心1分钟，弃去收集管中的液体，
[0047]t、加入700μL RNA wash buffer至吸附柱中，室温12000g离心1分钟，弃去收集管中的液体，
[0048]u、再加入400μL RNA wash buffer至吸附柱中，室温12000g离心1分钟，弃去收集管中的液体后，将空管再次室温离心1分钟，完全去除wash buffer，小心地将柱子移至RNase
‑
free离心管中，
[0049]v、加入10μL RNase
‑
free水至吸附柱中，室温离心1分钟洗脱RNA，
[0050]S1.7、取1μL步骤S1.6中的RNA溶液，用Qubit 3.0检测核酸浓度；
[0051]S2、无poly A尾RNA的加A反应
[0052]步骤S1.4的溶液中含有无poly A的RNA、rRNA和tRNA，利用RNA Clean&Concentrator
TM
‑
25试剂盒进行纯化，
[0053]S2.1、加入两倍体积的RNA binding buffer至每个样品管中，混匀后加入等体积的无水乙醇，混匀后将混合液加入至Zymo
‑
Spin
TM IICR Column中，室温离心1分钟，弃去收集管中的液体，
[0054]1)、加入400μL的RNA prep buffer至吸附柱中，室温离心1分钟，弃去收集管中的液体，
[0055]2)、加入700μL RNA wash buffer至吸附柱中，室温离心1分钟，弃去收集管中的液体，
[0056]3)、加入400μL RNA wash buffer至吸附柱中，室温离心1分钟，弃去收集管中的液体，
[0057]4)、将空管再次进行离心，室温离心1分钟，完全去除wash buffer。小心地把柱子移至RNase
‑
free的离心管中，
[0058]5)、加入30μL RNase
‑
free水至吸附柱中，室温离心1分钟洗脱RNA，
[0059]6)、配制加A反应体系，如下：
[0060]步骤5)中的RNA溶液30μL、10
×
E.coli Poly(A) Polymerase Reaction Buffer 4μL(1
×
)、ATP(10mM) 4μL、E.coli Poly(A) Polymerase 2μL，总体积为40μl；
[0061]7)、反应液于37℃孵育30分钟，之后加入EDTA至其终浓度为10mM，终止反应，
[0062]8)、用RNA Clean&Concentrator
TM
‑
5试剂盒纯化步骤7)的反应产物，具体操作为：
[0063]a1、加入两倍体积的RNA binding buffer至每个样品管中，混匀。加入等体积的无水乙醇，混匀，
[0064]a2、将混合液加入Zymo
‑
Spin
TM IICR Column中，室温下12000g离心1分钟，弃去收集管中的液体，
[0065]a3、加入400μL 的RNA prep buffer至吸附柱中，12000g离心1分钟，弃去收集管中的液体，
[0066]a4、加入700μL RNA wash buffer至吸附柱中，12,000g离心1分钟，弃去收集管中的液体，
[0067]a5、加入400μL RNA wash本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种直接RNA测序建库方法，其特征在于：包括以下步骤：S1、Poly A
+
RNA的富集，包括：S1.1、探针退火a、加入0.1
‑
1.0mg总RNA，于RNase
‑
free的1.5mL的无菌离心管中，用RNase
‑
free水补足体积至500μL，b、离心管于65℃孵育10分钟，c、加入3μL生物素化的Oligo(dT)探针、13μL 20
×
SSC至RNA溶液中，轻轻混匀，室温放置至冷却；S1.2、制备反应缓冲液，在等待RNA溶液冷却过程中，准备0.5
×
SSC和0.1
×
SSC缓冲液，具体包括：d、准备1.2mL无菌的0.5
×
SSC缓冲液，30μL的20
×
SSC缓冲液中加入1.170mL的RNase
‑
Free水混匀，b、准备1.4mL无菌的0.1
×
SSC缓冲液，包括：7μL的20
×
SSC缓冲液中加入1.393mL的RNase
‑
Free水混匀；S1.3、清洗磁珠，包括：e、重悬一管链霉亲和素磁珠0.6mL，轻弹管底至磁珠充分分散，将管置于磁力架上使磁珠被吸附至管壁一侧，f、小心移除上清液，不要离心，g、用300μL的0.5
×
SSC缓冲液清洗SA
‑
PMPs三遍，每次均用磁力架吸附、收集磁珠，小心移除上清液，h、最后用100μL的0.5
×
SSC重悬SA
‑
PMPs；S1.4、捕获和清洗Oligo(dT)
‑
mRNA杂交链，包括：i、将步骤S1.1、探针退火中的反应产物全部加至清洗后的SA
‑
PMPs中，轻轻混匀，j、室温孵育10分钟，每隔1
‑
2分钟轻轻颠倒混匀一次，k、用磁力架吸附、收集SA
‑
PMPs，小心吸取溶液至无菌的1.5mL离心管中，不要碰到磁珠，将离心管置于冰上，待用，m、用300μL的0.1
×
SSC缓冲液清洗磁珠，轻弹管底至磁珠充分重悬，移除上清，反复清洗四次；S1.5、洗脱mRNA，包括：n、用100μL的RNase
‑
free水重悬步骤S1.4、中的SA
‑
PMPs，轻弹管底重悬磁珠，o、磁力架吸附磁珠，吸取洗脱下来的mRNA溶液至无菌离心管中，同时保留磁珠，p、用150μL的RNase
‑
free水重复清洗SA
‑
PMPs一次，吸取溶液至上一步的管中，S1.6、纯化、浓缩洗脱的mRNA(RNA Clean&Concentrator
TM
‑
5)q、准备缓冲液：加入48mL的无水乙醇至12mL RNA Wash buffer，r、加入两倍体积的RNA binding buffer至步骤S1.5、洗脱mRNA中的每个样品管中，混匀，加入等体积的无水乙醇，混匀，将混合液加入至放入收集管中的Zymo
‑
Spin
TM
IICR Column中，室温12000g离心1分钟，弃去收集管中的液体，s、加入400μL的RNA prep buffer至吸附柱中，室温离心1分钟，弃去收集管中的液体，t、加入700μLRNA wash buffer至吸附柱中，
u、再加入400μL RNA wash buffer至吸附柱中，室温离心1分钟，弃去收集管中的液体后，将空管再次室温离心1分钟，完全去除wash buffer，小心地将柱子移至RNase
‑
free离心管中，v、加入10μL RNase
‑
free水至吸附柱中，室温离心1分钟洗脱RNA，S1.7、取1μL步骤S1.6中的RNA溶液，用Qubit 3.0检测核酸浓度；S2、无poly A尾RNA的加A反应步骤S1.4的溶液中含有无poly A尾RNA、rRNA和tRNA，利用RNA Clean&Concentrator
TM
‑
25试剂盒进行纯化，S2.1、加入两倍体积的RNA binding buffer至每个样品管中，混匀后加入等体积的无水乙醇，混匀后将混合液加入至Zymo
‑
Spin
TM
IICR Column中，室温离心1分钟，弃去收集管中的液体，1)、加入400μL的RNA prep buffer至吸附柱中，室温12000g离心1分钟，弃去收集管中的液体，2)、加入700μL RNA wash buffer至吸附柱中，室温12000g离心1分钟，弃去收集管中的液体，3)、加入400μL RNA wash buffer至吸附柱中，室温12000g离心1分钟，弃去收集管中的液体，4)、将空管再次进行离心，室温12000g离心1分钟，完全去除wash buffer。小心地把柱子移至RNase
‑
free的离心管中，5)、加入30μL RNase
‑
f...

【专利技术属性】
技术研发人员：童希文，周立光，吕颖健，殷亮，凡石美，赵越超，
申请(专利权)人：北京惠吉圣唯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：