一种高比活碱性木聚糖酶突变体制造技术

本发明专利技术涉及基因工程与蛋白质改造技术领域，具体涉及一种高比活碱性木聚糖酶突变体及其应用。本发明专利技术以野生型木聚糖酶H1为基础，提供了包含I37V、A59S、D63E、D104Y、T107M/K、N167G、D192E中至少一个突变位点的突变体。与野生型木聚糖酶H1相比，本发明专利技术提供的木聚糖酶突变体的比活力普遍提高了8.5%

【技术实现步骤摘要】
一种高比活碱性木聚糖酶突变体


[0001]本专利技术涉及基因工程和蛋白质工程
，具体涉及一种高比活碱性木聚糖酶突变体及其应用。

技术介绍

[0002]木聚糖是自然界中广泛存在的一种五碳糖，木聚糖酶是一类能将木聚糖降解为木二糖、木二糖以上的寡聚木糖及少量木糖等的酶，是在木聚糖降解过程中起关键作用的酶。由于木聚糖的组成成分复杂，其水解需要多种酶协同作用，所以广义上的木聚糖酶是指能够将木聚糖水解成寡糖或单糖的一系列酶的总称，包括内切β
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1,4
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D
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木聚糖酶、β
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D
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木糖苷酶、α
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L
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阿拉伯糖苷酶、α
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D
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葡糖苷酸酶、乙酰基木聚糖酶、酚酸酯酶等，狭义上的木聚糖酶指内切β
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1,4
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D
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木聚糖酶。木聚糖酶来源非常广泛，可以由不同种类的微生物产生。根据木聚糖酶对酸碱环境的耐受度，可以将其分为碱性、中性和酸性。
[0003]碱性木聚糖酶在造纸工业、饲料行业及食品工业中都起着十分重要的作用，尤其在造纸的制浆、促进漂白及废纸脱墨等的工业生产中，碱性木聚糖酶能显著降低造纸过程中的污染排放，提高产品的质量。使用木聚糖酶AU
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PE89对碱法麦草浆进行漂前预处理，使得成品浆A等品率提升1.43%，细浆得率提高1.48%，抄片强度指标均有所提升，降低了洗漂段纤维的损伤。有研究在纸浆漂白过程中加入了产自节杆菌(Arthrobacter sp．) MTCC5214的木聚糖酶，结果发现硫酸盐浆的卡伯值降低了20%，相当于漂白过程中用氯减少了29%，且与未处理的纸浆相比，酶处理使得纸浆的亮度提高了9.6%。
[0004]为了扩大碱性木聚糖酶在生产应用中的适用范围，近年来许多学者利用克隆技术和基因工程技术，对自然界中分离出来的碱性木聚糖酶的基因进行表达纯化及扩大培养，目前已取得较大进展。例如，Bai等对来自嗜碱枯草芽孢杆菌( Bacillus subtilis) SN5的木聚糖酶 Xyn11A
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LC进行结构比较和突变分析，发现在pH较高的条件下，碱性木聚糖酶带电残基含量增加，且相对于中性和酸性木聚糖酶，碱性木聚糖酶的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸数量较少，突变分析显示至少有六个氨基酸（Glu16，Trp18，Asn44，Leu46，Arg48，Ser187）的参与使酶在碱性条件下具有更高的活性。Long等采用双质粒共同表达的方法将来自黑曲霉(Aspergillus niger)的木聚糖酶基因转入毕赤酵母( Pichia pastoris) 中表达，使其表达能力提高了33%，通过优化培养条件，表达能力较摇瓶培养提高了2.4倍，为生产中提高木聚糖酶产量提供了新的方法。刘俊等通过易错PCR法和双酶切载体重构建法建立了木聚糖酶基因随机突变文库，从中筛选出四个在pH 8.0 ~ 9.5 范围内相对酶活性均比出发菌株酶高15%左右的突变体，再将四个突变位点进行组合突变，各个组合突变体酶与底物的亲和力和催化效率都比野生型出发菌株酶高，pH稳定性也显著高于野生型酶。
[0005]目前使用的木聚糖酶存在比酶活低、不稳定、成本高，不能满足生产需要等问题，需要通过分子改造进行性质优化。本专利技术即提供了一种具有高比酶活的碱性木聚糖酶，可使其更适合于在工业领域中的实际应用。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种碱性木聚糖酶突变体。所述突变体的比活力比野生型得到显著提高，有利于其在工业领域的广泛应用。
[0007]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术涉及一种木聚糖酶突变体，其包含与SEQ ID NO:1具有至少90%同一性的氨基酸序列，且与SEQ ID NO:1相比在选自下组中的至少一个位置上包含氨基酸的取代：37，59，63，104，107，167，192。
[0008]在本专利技术的一些实施例中，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比具有至少91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，或至少99%的同一性。
[0009]在一些更具体的实施例中，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比具有至少99.1%，99.2%，99.3%，99.4%，99.5%，99.6%，99.7%，99.8%，或至少99.9%的同一性。
[0010]在本专利技术的一些实施例中，所述突变体包含下组中至少一个氨基酸的取代：I37V、A59S、D63E、D104Y、T107M/K、N167G、D192E。
[0011]本专利技术还涉及编码上述木聚糖酶突变体的DNA分子。
[0012]本专利技术还涉及包含上述DNA分子的重组表达载体。
[0013]本专利技术还涉及一种宿主细胞，包含上述重组表达载体。
[0014]将上述的质粒转入宿主细胞中，重组表达的木聚糖酶突变体的比活力得到显著提升。
[0015]在本专利技术的一些实施例中，宿主细胞为毕赤酵母（Pichia pastoris）。
[0016]在本专利技术的一些实施例中，宿主细胞为里氏木霉（Trichoderma reesei）。
[0017]本专利技术还提供了上述木聚糖酶突变体在造纸领域中的应用。
[0018]本专利技术以野生型木聚糖酶H1为基础，提供了包含I37V、A59S、D63E、D104Y、T107M/K、N167G、D192E中至少一个突变位点的突变体。与野生型木聚糖酶H1相比，本专利技术提供的木聚糖酶突变体的比活力普遍提高了8.5%
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32.8%；其中，含D192E单点突变的木聚糖酶突变体的比活力最高，达1625.11 U/mg，取得了意料不到的技术效果。
[0019]综上，本专利技术提供的木聚糖酶突变体的比活力得到显著提高，从而有利于降低木聚糖酶的生产成本，促进其在工业领域中的广泛应用。
具体实施方式
[0020]本专利技术公开了一种碱性木聚糖酶突变体、其制备方法及应用、编码该碱性木聚糖酶突变体的DNA分子、载体、宿主细胞，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。
[0021]本专利技术用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECΜLAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，3nd Ed. (Sambrook, 2001)和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECΜLAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本专利技术所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种木聚糖酶突变体，其特征在于，所述突变体包含与SEQ ID NO:1具有至少90%同一性的氨基酸序列，且与SEQ ID NO:1相比在选自下组中的至少一个位置上包含氨基酸的取代：37，59，63，104，107，167，192。2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比具有至少91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，或至少99%的同一性。3.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比具有至少99.1%，99.2%，99.3%，99.4%，99.5%，99.6%，99.7%，99.8%，或至少99.9%的同一性。4.如权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：鲍锴，吴秀秀，李馨培，于靖，
申请(专利权)人：青岛蔚蓝生物集团有限公司，
类型：发明
国别省市：