一种优化环介导等温扩增反应的方法技术

本发明专利技术公开了一种优化环介导等温扩增反应的方法，属于生物技术领域。本发明专利技术所提供的方法为将石蜡块加入到环介导等温扩增反应体系当中进行核酸扩增，同时，在反应混合物中不包括甜菜碱。本发明专利技术方法可有效提高环介导等温扩增反应的灵敏度，并且能够抑制假阳性结果的出现、减少非特异性扩增，从而提高的检测效率。可以被应用于食品安全检测等领域，具有广泛应用前景。用前景。用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种优化环介导等温扩增反应的方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种优化环介导等温扩增反应的方法。

技术介绍

[0002]环介导等温扩增反应（Loop
‑
mediated isothermal amplification，缩写为LAMP）是一种在等温条件下进行核酸扩增的技术，可以广泛应用于食品安全检测等领域。该技术灵敏度高，在等温条件下扩增15min
‑
1h即可产生109～10
10
倍的扩增子，若实验环境被气溶胶污染，则很容易产生假阳性结果。另外，由于扩增反应过程中涉及到多条引物，引物间很容易发生非特异性结合产生引物二聚体，从而消耗反应体系中的反应底物，降低反应效率和检测灵敏度，同时又容易导致结果假阳性，使得结果误判。因此，如何优化环介导等温扩增反应体系，使得其既有较高检测灵敏度、又抑制非特异性扩增，一直是该
急需解决的技术难题。

技术实现思路

[0003]克服现有环介导等温扩增检测技术中所遇到的由于灵敏度高、实验环境易被气溶胶污染以及多条引物间发生非特异性结合而容易产生假阳性和灵敏度降低的问题，本专利技术提供一种优化环介导等温扩增反应的方法。以便进一步提高检测的灵敏度、抑制非特异性扩增，解决在环介导等温扩增检测方面遇到的技术难题。
[0004]本专利技术通过以下方案解决所述的技术问题：一种优化环介导等温扩增反应的方法，通过向环介导等温扩增反应体系中添加石蜡块同时避免使用甜菜碱来实现反应体系优化，包括如下步骤：（1）在反应管底部加入反应混合物I；（2）加入石蜡块，盖上管盖，60℃融化、冷却，其中，石蜡块的用量为：如在25
µ
L的核酸扩增反应体系中加入石蜡块融化后的体积为8
µ
l；（3）加入反应混合物II；（4）进行等温扩增反应；（5）核酸扩增产物检测：通过电泳检测、浊度检测或显色检测。
[0005]本专利技术通过向环介导等温扩增反应体系中添加石蜡块，同时避免使用甜菜碱的方法来实现优化效果，提供了一种优化环介导等温扩增反应的方法。采用本专利技术的检测方法检测，具有高灵敏度和高特异性的优点。
[0006]进一步的，加入的石蜡块的熔点为48
‑
50℃。
[0007]本专利技术方法中，反应混合物I包括但不限于dNTP、外引物F3和B3、内引物FIP和BIP、Bst DNA聚合酶、聚合酶缓冲液、Mg
2+ 、MnCl2。反应混合物I不包括甜菜碱。
[0008]本专利技术方法中，反应混合物II包括但不限于dNTP、外引物F3和B3、内引物FIP和BIP、Bst DNA聚合酶、聚合酶缓冲液、Mg
2+
、MnCl2。反应混合物II不包括甜菜碱。
[0009]本专利技术方法中，在一具体实施方案中，所述反应混合物包括dNTP 1.0
‑
1.6 mmol/
L，外引物F3和B3各0.2μmol/L，内引物FIP和BIP各1.6μmol/L，BstDNA聚合酶8U，1
×
聚合酶缓冲液，Mg
2+2‑
9mmol/L。例如，1
×
BstDNA聚合酶反应缓冲液可以选用1
×
Thermopol反应缓冲液，包含Tris
‑
HCl(pH8.8)20mmol/L，KCl10mmol/L，(NH4)2SO410mmol/L，0.1%TritonX
‑
100，MgSO42mmol/L。本专利技术方法中，所述等温扩增反应的反应程序为
①
60～65℃孵育10～90min；
②
80℃终止反应2~20min。本专利技术不限制通过其他适宜反应程序来实现本专利技术检测方法。
[0010]本专利技术方法中，扩增结果检测方法包括但不限于电泳检测、浊度检测或显色检测（包括肉眼直接观察或借助仪器进行扩增曲线判断）等。
[0011]本专利技术方法中，显色检测包括但不限于钙黄绿素、SybrGreenI、GelRed等。
[0012]本专利技术为生物
提供了一种利用石蜡块，同时避免使用甜菜碱来优化环介导等温扩增反应的方法。本专利技术有益效果包括：采用本专利技术检测方法具有特异性强、灵敏度高的优点。与目前常用的环介导等温扩增检测方法相比，本专利技术通过向环介导等温扩增反应体系中加入石蜡块，同时避免使用甜菜碱来实现对环介导等温扩增的体系优化，操作简单，效果极佳，非常适于食品安全检测等领域推广使用。基于本领域常识可将上述各优选条件进行任意组合，均属本专利技术保护范围。
附图说明
[0013]附图1表明本专利技术实施例1甜菜碱对沙门氏菌LAMP扩增反应效果的影响；附图2表明本专利技术实施例2石蜡对阪崎克罗诺杆菌LAMP扩增反应体系的优化效果；附图3表明本专利技术实施例2不加入石蜡块的反应体系的扩增结果。
具体实施方式
[0014]结合以下具体实施例和附图，对本专利技术作进一步的详细说明，本专利技术的保护内容不局限于以下实施例。在不背离专利技术构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本专利技术中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本专利技术的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本专利技术没有特别限制内容。
[0015]实施例1甜菜碱对于LAMP扩增反应的影响：制备核酸扩增反应体系，组成如下表1：
其中引物FIP、BIP、F3和B3为沙门氏菌特异性核酸扩增引物（专利CN106367493 B中的引物组A），模板为沙门氏菌DNA（菌种购自中国普通微生物菌种保藏中心，菌株编号为CGMCC 1.1859，经培养后使用北京天根生物工程公司的细菌核酸提取试剂盒提取基因组DNA）。在63℃条件下进行核酸反应。
[0016]扩增结果如图1所示，上方浅色线代表反应混合物中不添加甜菜碱后的扩增结果，下方深色线代表反应混合物中添加甜菜碱后的扩增结果，不加甜菜碱的反应（上方浅色线）比添加甜菜碱的反应（下方深色线）DNA合成速度更快。该核酸扩增结果显示，在LAMP扩增反应体系中，添加甜菜碱在一定程度上降低反应灵敏度。
[0017]实施例2利用石蜡对阪崎克罗诺杆菌环介导等温扩增反应体系的优化阪崎克罗诺杆菌环介导等温扩增反应体系见下表2：其中，引物FIP、BIP、F3和B3为阪崎克罗诺杆菌特异性核酸扩增引物（专利CN106244706 B中的引物组A），模板为阪崎克罗诺杆菌DNA（菌种购自种来源中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号 CICC21560(＝ATCC29544)，经培养后使用北京天根生物工程公
司的细菌核酸提取试剂盒提取基因组DNA）。
[0018]针对阪崎克罗诺杆菌环介导等温扩增的优化改进，包括下列步骤：（1）在反应管底部加入反应混合物I（dNTP）4
µ
l；（2）加入事先准备好的熔点为48
‑
50℃石蜡块，融化后约为8
µ
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种优化环介导等温扩增反应的方法，其特征在于，通过向环介导等温扩增反应体系中添加石蜡块同时避免使用甜菜碱来实现wsg txi 优化，包括如下步骤：（1）在反应管底部加入反应混合物I；（2）加入石蜡块，盖上管盖，60℃融化、冷却，其中，石蜡块的用量为：在25
µ
L的核酸扩增反应体系中加入石蜡块融化后的体积为8
µ
l；（3）加入反应混合物II；（4）进行等温扩增反应；（5）核酸扩增产物检测：通过电泳检测、浊度检测或显色检测。2.根据权利要求1所述的一种利优化环介导等温扩增反应的方法，其特征在于，所述的石蜡块的熔点为48
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：崔大祥，李雪玲，田静，仲禺俊，沈琦，李玥，
申请(专利权)人：上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司，
类型：发明
国别省市：