AuNPs-DNA水凝胶及应用与基于CRISPR-Cas12a的靶基因检测方法技术

本发明专利技术属于核酸检测领域，涉及一种AuNPs

【技术实现步骤摘要】
AuNPs
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DNA水凝胶及应用与基于CRISPR
‑
Cas12a的靶基因检测方法


[0001]本专利技术属于核酸检测领域，具体地，涉及一种用于CRISPR
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Cas12a检测靶基因的AuNPs
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DNA水凝胶、该AuNPs
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DNA水凝胶在基于CRISPR
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Cas12a的靶基因检测和/或制备基于CRISPR
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Cas12a的靶基因检测试剂盒中的应用、一种基于CRISPR
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Cas12a的可视化检测靶基因的方法以及一种基于CRISPR
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Cas12a的可视化检测靶基因的试剂盒。

技术介绍

[0002]抗生素自二十世纪四十年代使用以来，大大降低了感染性疾病的发病率和死亡率，然而随着其在临床和畜牧业养殖中的过度使用，又引发了新的公共卫生问题，当前抗生素耐药性已成为全球主要死亡原因。作为一种在动物养殖工业中广泛使用的饲料型抗生素，杆菌肽的滥用不仅造成其在动物性食品中的残留，同时会改变环境、动物和食品中细菌的耐药性，进而造成杆菌肽抗性决定因子bcrABDR在临床病原菌中的出现和广泛传播。因此，建立动物性食品中抗杆菌肽基因bcrA的快速、可视化的超灵敏检测技术，在监测动物生产系统中细菌杆菌肽的耐药性，防止耐药基因沿“环境
‑
动物
‑
食品”链条向人群传播和扩散以及保护消费者的食品安全与维护公众健康等方面具有重要意义。
[0003]目前针对耐药基因的检测主要依赖聚合酶链式反应(PCR)以及反转录PCR扩增实现，虽然其具有较高的准确率，但存在耗时长且成本高昂，需要精密的仪器以及复杂的多步反应等缺点。为了克服常规核酸检测的局限性，包括滚环扩增(RCA)、重组聚合酶扩增(RPA)、指数放大反应(EXPAR)、螺旋酶依赖性扩增(HDA)等在内的核酸等温扩增(INAP)技术得到长足发展，其中环介导等温扩增(LAMP)在Bst DNA聚合酶作用下恒温1小时内即可实现109～10
10
倍的核酸扩增，其与敏感生物标记物相结合的生物传感技术已广泛应用于核酸检测领域。
[0004]DNA聚合物杂化水凝胶是核苷酸链通过物理或化学交联后在水溶液中形成的三维网络结构，其自1996年被Nagahara首次报道以来，因在生物医学和生物传感器方面的巨大应用潜力被广泛关注。通过将响应性聚合物骨架或交联单元设计为开关，可在有无目标分子情况下呈现“打开”或“关闭”的状态，当开关被目标物打开时，包裹在DNA水凝胶中的纳米材料或酶将作为信号输出分子得以释放，基于此原理构建的智能响应水凝胶可实现对核酸、金属离子、小分子物质等进行可视化检测。

技术实现思路

[0005]为解决动物性食品中抗杆菌肽基因的常规检测方法操作过程繁琐、依赖温度循环、检测效率低的技术问题，本专利技术旨在提供一种操作简单、检测灵敏、结果可视的快速检测方法，以实现对动物性食品中抗杆菌肽基因bcrA的可视化检测和鉴定。
[0006]本专利技术的目的在于提供一种用于可视化超灵敏检测抗杆菌肽基因的材料和方法，基于CRISPR
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Cas12a的AuNPs
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DNA水凝胶的制备，建立抗杆菌肽基因bcrA的可视化检测体
系。其中DNA水凝胶能够放大信号并提高检测灵敏度，借助LAMP技术扩增目标DNA，经CRISPR
‑
Cas12a系统对目标DNA的识别并激活反式切割活性，DNA水凝胶裂解进而释放出包埋在其中的金纳米粒子，实现对抗杆菌肽基因bcrA的可视化检测，进一步对释放的金纳米粒子的测量，也可实现对bcrA基因的定量检测。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术提供一种用于CRISPR
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Cas12a检测靶基因的AuNPs
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DNA水凝胶，所述AuNPs
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DNA水凝胶包括水凝胶、包埋于水凝胶内的AuNPs粒子、与水凝胶固定连接的DNA链：X链、Y链，以及与X链、Y链中的至少部分均互补配对的Linker链。
[0008]根据本专利技术一种优选实施方式，所述AuNPs粒子的平均粒径为10
‑
50nm；所述AuNPs粒子上修饰有PEG。
[0009]具体地，通过以下方法合成并修饰AuNPs材料：用高锰酸钾或铬酸洗液洗净所用的烧杯和镊子，在烧杯中加入超纯水，再加入氯金酸溶液，磁力搅拌下加热煮沸，随后加入柠檬酸钠溶液，继续煮沸后静置冷却至室温，将过量的PEG2000
‑
SH在超纯水中溶解后与合成的金纳米粒子搅拌混匀，室温下轻搅一定时间，将制备好的PEG
‑
金纳米粒子用超滤管离心，水洗两次，除去未反应的PEG2000
‑
SH。
[0010]根据本专利技术一种优选实施方式，所述AuNPs
‑
DNA水凝胶由包括以下步骤的方法制得：
[0011]将5
’
端分别功能化的X链和Y链与Linker链混合进行聚合反应，Linker链通过碱基互补配对与X链和Y链结合，然后加入修饰PEG的AuNPs，得到所述AuNPs
‑
DNA水凝胶；
[0012]所述水凝胶聚合体系包括聚合单体、引发剂、任选的加速剂；
[0013]X链和Y链的5
’
端功能化有衍生自水凝胶聚合单体的基团或衍生自能够与所述水凝胶聚合单体共聚的基团。
[0014]根据本专利技术一种优选实施方式，所述水凝胶为丙烯酰胺水凝胶。相应地，所述聚合单体为丙烯酰胺，所述引发剂为APS，所述加速剂为TEMED，X链和Y链的5
’
端功能化有甲基丙烯基。
[0015]根据本专利技术，使用单链的Linker链DNA与两个引物单链DNA(X链和Y链)交联并形成桥梁。设计的X链/Y链与Linker链的两端区域碱基互补，并在线性聚合物上形成聚合物链PA
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X和PA
‑
Y，其中Linker链作为交联剂用于与PA
‑
X和PA
‑
Y杂交形成水凝胶，PEG
‑
AuNPs被包埋在DNA水凝胶中。
[0016]符合上述设计思路的序列即可用于本专利技术。根据本专利技术一种优选实施方式，X链和Y链的长度各自独立地为18
‑
30nt；Linker链的长度为60
‑
100nt；Linker链的两端分别与X链和Y链的至少一端完全互补配对，优选Linker链富含AT碱基；所述完全互补配对的长度为12
‑
20nt。
[0017]更具体地，所述X链的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示，所述Y链的核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示，所述Linker链的核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示。
[0018]5’‑
Acrydite本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
NO：8所示；所述LAMP的反应条件包括：Mg
2+
的浓度为5
‑
10nM，dNTPs的浓度为1
‑
2nM，Bst酶的浓度为0.3
‑
0.4U/μL，反应温度为60
‑
65℃，反应时间大于15min；所述Cas12a蛋白选自FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a和Lb4Cas12a中的至少一种；所述靶基因为抗杆菌肽基因bcrA；所述待测样品为食品，优选为牛奶或动物性食品；所述crRNA的核苷酸序列为SEQ ID NO：9所示。10.一种基于CRISPR
‑
Cas12a的可视化检测靶基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下组分：(i)权利要求1
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6中任意一项所述的AuNPs
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DNA水凝胶；(ii)LAMP反应体系，包括等温扩增缓冲液、dNTPs、Mg
2+

【专利技术属性】
技术研发人员：高志贤，韩殿鹏，王江，杜玉婉，李双，彭媛，白家磊，周焕英，秦康，任舒悦，王瑜，李森，季帅峰，
申请(专利权)人：军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所，
类型：发明
国别省市：