一种用于骨干载体的pegRNA表达框及相应骨干载体和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于骨干载体的pegRNA表达框及相应骨干载体和应用。本发明专利技术的骨干载体包括融合蛋白、pegRNA；所述融合蛋白为Cas9切刻酶或其变体、反转录酶组成的融合蛋白。pegRNA包含靶向目的DNA片段的sgRNA、逆转录模板和引物结合位点、连接得到的RNA分子。本发明专利技术所述骨干质粒载体中，pegRNA表达框和融合蛋白表达框位于同一双元载体中，pegRNA表达框依次由35S

【技术实现步骤摘要】
一种用于骨干载体的pegRNA表达框及相应骨干载体和应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及引导编辑系统及其在基因组碱基编辑中的应用。

技术介绍

[0002]基因编辑技术可有目的的实现基因组中特定DNA片段的敲除、插入和替换。 CRISPR/Cas以其易用性和高效性的优点成为主流基因组编辑技术，正日益深刻的影响着植物学的发展。目前多数相关研究利用CRISPR
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Cas系统在植物基因组特定位点产生DNA双链断裂(Double strand break,DSB)，并通过错误倾向性的非同源末端连接(Non
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homologous end joining,NHEJ)修复失活目标基因。由于 NHEJ修复介导的碱基插入缺失存在一定的随机性，难以实现精确的基因组编辑。借助于同源介导修复(homology
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directed repair,HDR)机制，CRISPR
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Cas系统可在外源DNA供体(donor)的指导下实现精准的碱基替换或片段插入缺失。但是在植物细胞中，由于重组频率偏低和DNAdonor的递送困难，CRISPR介导的HDR 效率显著受限，往往难以高效的实现基因组精确编辑。
[0003]2019年底，David Liu研究组报道了不同于单碱基编辑的基因组精确编辑技术，即引导编辑(prime editing,PE)系统。该系统利用nSpCas9(H840A)和工程化改造M
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MLV RT反转录酶(Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase) 融合构建引导编辑器(prime editor)，并利用prime editing guide RNA(pegRNA) 最终实现靶位点的基因编辑。pegRNA由3个部分组成，包括single
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guide RNA (sgRNA)、引物结合位点(Prime Binding Site，PBS)和储存有靶向位点编辑信息的反转录模板(RT template)。由pegRNA中guide RNA部分引导在人细胞基因组靶位置附近形成编辑链上的单链切口，进而通过pegRNA中的PBS序列引导以含有目标编辑序列的逆转录模板将突变精确导入基因组中。
[0004]相对于其他的编辑技术，引导编辑展示了优越性：1、引导编辑可完成的编辑类型广泛，不仅可以实现12种任意类型的碱基替换，还可精确高效的导入小片段插入以及80bp以内的片段缺失。2、引导编辑受PAM的限制相对较小，在长达33nt的PAM远端序列内，多个位点都可以高效编辑。3、引导编辑更为精准，当在目标位点附近有多个相同碱基时，不会受到碱基编辑器bystandermutation问题的困扰。
[0005]在植物中，国内多个课题组均在水稻、玉米等建立了植物引导编辑系统 (PPE)，可灵活地在作物中实现单碱基和多碱基替换、小片段插入缺失等其他编辑工具无法完成的多种精确突变，极大拓展了植物基因组精准编辑系统。但目前植物引导编辑效率偏低，通常在8％以下，所产生的突变体多为嵌合突变，严重制约了其应用。因此，有必要开发出一种高效的植物引导编辑系统，更好的为植物基因功能解析和作物遗传改良提供有利工具。

技术实现思路

[0006]本专利技术所要解决的技术问题是如何提高植物引导编辑系统的精确编辑效率。
[0007]为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了一种用于骨干载体的pegRNA表达框，其
特征在于，所述pegRNA表达框包含启动子、tRNA基因序列、壮观霉素抗性基因SpR、EQ序列、RNA核酶HDV序列和终止子，其中，所述tRNA基因的核苷酸序列如Seq ID No.1第1274至1345位所示，所述壮观霉素抗性基因 SpR的核苷酸序列如Seq ID No.1第1452至2558位所示，所述EQ序列的核苷酸序列如Seq ID No.1第2566至2607位所示，RNA核酶HDV的核苷酸序列如 Seq ID No.1第2608至2675位所示。
[0008]优选地，所述pegRNA表达框的核苷酸序列如序列表中Seq ID No.1的第274 至2954位所示，其中，所述启动子为35S
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CmYLCV
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U6复合启动子，所述终止子为polyT
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HSPt复合终止子。
[0009]另一方面，本专利技术提供一种高效的植物引导编辑系统。所述植物引导编辑系统含有pegRNA，所述pegRNA为由靶向目的DNA片段的sgRNA、逆转录模板 (RT)和引物结合位点(PBS)连接得到的RNA分子。此外，在pegRNA的3
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增加 EQ结构，避免pegRNA的3
’
被RNA酶降解，其次使用35S
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CmYLCV
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U6复合启动子驱动pegRNA的表达，以增强pegRNA的表达。
[0010]所述植物引导编辑系统还含有Cas9切口酶(H840A)或变体与逆转录酶 MMLV融合所形成的融合蛋白。通过使用Cas9切口酶变体(H840A/R221K/N394K) 以及不同类型的核定位信号NLS，产生优化的融合蛋白结构，提高其作用活性。
[0011]本专利技术还提供了一种骨干载体，所述载体含有pegRNA的表达框和融合蛋白表达框。所述向导RNA表达框的核苷酸序列如Seq ID No.1中第274至2954位所示，所述Cas9核酸酶表达框的核苷酸序列如Seq ID No.1中第2961至11653 位所示，其特征在于，
[0012]所述pegRNA表达框依次包括：35S
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CmYLCV
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U6复合启动子、tRNA基因序列、壮观霉素抗性基因SpR、EQ序列、RNA核酶HDV序列和polyT
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HSPt复合终止子。其中，所述35S
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CmYLCV
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U6复合启动子的核苷酸序列如Seq ID No.1 第274至1266位所示，tRNA基因的核苷酸序列如Seq ID No.1第1274至1345 位所示，壮观霉素抗性基因SpR的核苷酸序列如Seq ID No.1第1452至2558位所示，EQ序列的核苷酸序列如Seq ID No.1第2566至2607位所示，RNA核酶 HDV的核苷酸序列如Seq ID No.1第2608至2675位所示，polyT
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HSPt复合终止子的核苷酸序列如Seq ID No.1第2676至2954位所示。
[0013]在本专利技术中，SpR基因两端分别存在反向排列的BsaI内切酶识别位点(剪切位点如Seq ID No.1第1346位和2559位所示)，用于插入目的基因sgRNA、sgRNA 骨架、相应的逆转录模板(RT)和引物结合位点(PBS)片段。
[0014](2)所述融合蛋白表达框包括ZmUBI启动子、改本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于骨干载体的pegRNA表达框，其特征在于，所述pegRNA表达框包含启动子、tRNA基因序列、壮观霉素抗性基因SpR、EQ序列、RNA核酶HDV序列和终止子，其中，所述tRNA基因的核苷酸序列如Seq ID No.1第1274至1345位所示，所述壮观霉素抗性基因SpR的核苷酸序列如Seq ID No.1第1452至2558位所示，所述EQ序列的核苷酸序列如Seq ID No.1第2566至2607位所示，RNA核酶HDV的核苷酸序列如Seq ID No.1第2608至2675位所示。2.根据权利要求1所述的用于骨干载体的pegRNA表达框，其特征在于，所述pegRNA表达框的核苷酸序列如序列表Seq ID No.1的第274至2954位所示，其中，所述启动子为35S
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CmYLCV
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U6复合启动子，所述终止子为polyT
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HSPt复合终止子。3.一种用于植物引导编辑系统的骨干载体，其特征在于，其包含权利要求1所述的pegRNA表达框和融合蛋白表达框。4.根据权利要求3所述的导编辑系统骨干载体，其特征在于，所述壮观霉素抗性基因SpR用于替换为靶向目的DNA片段的sgRNA、sgRNA骨架序列、逆转录模板RT和引物结合位点PBS、8bp linker序列。5.根据权利要求4所述的骨干载体，其特征在于，所述融合蛋白表达框包括ZmUBI启动子、经改造后的Cas9切刻酶或其变体编码序列、逆转录酶M
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MLV RT编码序列和35s终止子，其中，ZmUBI启动子的核苷酸序列如Seq ID No.1第2961至4939位所示，Cas9切刻酶的核苷酸序列如Seq ID No.1第4979至9079位所示，逆转录酶M
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MLV RT的核苷酸序列如Seq ID No.1第9182至11254位所示，35s终止子的核苷酸序列如Seq ID No.1第11389至11653位所示。6.根据权利要求5所述的骨干载体，其特征在于，融合蛋白表达框...

【专利技术属性】
技术研发人员：李娟，许蓉芳，秦瑞英，魏鹏程，金珊，刘小双，陈俐克，丁健，李亦臻，
申请(专利权)人：安徽省农业科学院水稻研究所，
类型：发明
国别省市：