枯草芽孢杆菌抗菌肽BsR1及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体公开了枯草芽孢杆菌抗菌肽BsR1及其应用，申请人通过指示菌内置文库技术，构建枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）330

【技术实现步骤摘要】
枯草芽孢杆菌抗菌肽BsR1及其应用


[0001]本领域属于生物
，具体涉及枯草芽孢杆菌抗菌肽BsR1及其应用。

技术介绍

[0002]枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)属芽孢杆菌属，革兰氏阳性菌，周生鞭毛，能运动，可形成内生抗逆芽孢，是一种需氧菌。枯草芽孢杆菌同时也是一种植物内生菌，在植物健康和抗病中起着至关重要的作用。内生细菌的发生密度低于病原体，并且通常不会在宿主中引起任何过敏反应，这表明宿主植物不将其视为病原体(Hallmann,von Quadt et al.2011)。据报道，几种内生细菌和根际细菌对作物健康具有有益作用(Wilhelm,Arthofer et al.1998,Santoyo,Moreno
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Hagelsieb et al.2015,Goswami,Deka et al.2017,Walitang,Kim et al.2017)。在不同植物中被报告为内生菌的细菌属包括芽孢杆菌，伯克霍尔德氏菌，纤维单胞菌，锁骨杆菌，弯曲杆菌，杆状芽孢杆菌，假单胞菌，根瘤菌，沙雷氏菌等(Recuenco and Vuurde 2000,Lodewyckx,Vangronsveld et al.2002,Zinniel,Lambrecht et al.2002)。大多数内生菌起源于根际。然而，也有报道称某些细菌通过种子垂直传播(Truyens,Weyens et al.2014)。许多内生细菌显示出对抗真菌植物病原体的拮抗潜力。内生菌也可以通过生产一系列天然产物而受益，这些天然产物可以用于医药，农业或工业(Ryan,Germaine et al.2008)。
[0003]抗菌肽(AMPs)，也被称为宿主防御肽，是一种短而又通常带正电荷的肽，存在于从微生物到人类的各种生命形式中(Mahlapuu,Hakansson et al.2016)。通常低于30
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40个氨基酸，一般都具有抗菌活性。AMP是多种多样的，并且可以根据它们的来源、组成和结构细分为几组。然而，它们也具有某些共同的结构特征，例如(i)氨基酸组成：AMP中最丰富的残基是阳离子(精氨酸和赖氨酸)和疏水性(色氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)；(ii)净电荷：大多数AMP在生理pH值下带正电荷，尽管少数亚组包括阴离子肽；(iii)两亲性：由其氨基酸组成和排列所赋予的；(iv)结构和构象的多样性，包括α
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螺旋、β
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折叠、非常规结构，甚至扩展构象(后两者在短AMP中特别丰富)。大多数这些结构是两亲性的，在特定的实验条件下诱导，这也促进了它们与脂质双层的相互作用。事实上，生物膜诱导的AMP两亲性是与抗菌活性相关的标志性特性(Marcos,Munoz et al.2008)。我们利用抗菌肽的这些基本特征，结合生物信息学预测和合理设计，最终合成了一种具有广谱抗性的抗菌肽BsR1，通过体外抑菌实验测定，发现其具有良好的抗菌活性和稳定性，可作为今后抗菌剂研究的基础。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供枯草芽孢杆菌抗菌肽BsR1，所述抗菌肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。
[0005]本专利技术的另一个目的在于提供枯草芽孢杆菌抗菌肽BsR1在制备抑菌剂中的应用。
[0006]为了完成上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]申请人通过构建一个高质量的枯草芽孢杆菌330
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2基因组文库，利用同源重组法
转化禾谷镰刀菌5035菌株，筛选表型具有较大差异的突变体，PCR检测插入片段。将筛选得到的基因构建到pBE
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S载体上，利用指示菌内置文库技术表达该基因。该多肽具有抗菌活性，导致其宿主细胞裂解死亡，利用生物信息学手段预测活性区域并合成短肽。所述抗菌肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。所述的抗菌肽可用任何领域制备蛋白的方式得到，包括但不限于原核表达，合成等。
[0008]编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列也属于本专利技术的保护范围。
[0009]抗菌肽BsR1的应用，包括利用该抗菌肽制备成抑菌剂以及抗菌药物；通过电镜实验可以看到，本专利技术的抑菌肽通过破坏细菌细胞膜来达到抑菌目的。
[0010]所述的抑菌剂可抑制的细菌包括但不限于：枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，青枯病菌(R.solanacearum)，稻黄单胞菌条斑病致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)，小麦苗枯病菌(C.fangii)、野油菜黄单胞菌栖绒毛致病变种(Xanthomonas campestris pv.Holcicola)、和/或番茄溃疡病菌(C.michiganensis)。
[0011]与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：
[0012]本专利技术提供的抗菌肽BsR1能有效抑制供试的革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的正常生长，且热稳定性以及紫外稳定性较强。溶血实验及毒性试验证明该基因对哺乳动物和人无害。该抗菌肽基因从枯草芽孢杆菌中筛选得到，在后期研究中有望用于对水稻上重要病虫害防治中的生物防治，或可作为抗菌剂应用。
附图说明
[0013]图1为筛选出的抗菌肽BsR1双层板抑菌实验结果图；
[0014]其中图1中A为Bacillus sp.A，B为Bacillus sp.K1，C为Rastonia solanacearum R 21
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5，D为Xanthomonas oryzae pv.oryzicola RH3，E为Xanthomonas oryzae pv.oryzae XG
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25，F为Xanthomonas oryzae pv.oryzae Xoo，G为Clavibacter fangii菌株，H为Xanthomonas campestris pv.Holcicola 1.153，I为Clavibater michiganensis YCK。
[0015]图2为抗菌肽BsR1最小抑菌浓度(MIC)测定；
[0016]其中纵坐标为OD600的数值，横坐标为稀释的抗菌肽的终浓度。阴性对照为无菌水，阳性对照为多粘菌素B(Polymyxin B)。
[0017]图3为抗菌肽BsR1的酸碱稳定性测定结果示意图；
[0018]其中Ⅰ为抗菌肽BsR1与HCl(pH＝3)溶液共孵育处理，Ⅱ为抗菌肽BsR1与HCl(pH＝4)溶液共孵育处理，III为抗菌肽BsR1与HCl(pH＝5)溶液共孵育处理，IV为抗菌肽BsR1与NaOH(pH＝8)溶液共孵育处理，
Ⅴ
为抗菌肽BsR1与NaOH(pH＝9)溶液共孵育处理，
Ⅵ
为抗菌肽BsR1与NaOH(pH＝10)溶液共孵育处理，
Ⅶ
为抗菌肽BsR1与H2O(pH＝6)溶液共孵育处理。
[0019]图4为抗菌肽BsR1的热稳定性测定结果示意图；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人工合成的抗菌肽，所述抗菌肽为SEQ ID NO.1所示。2.编码权利要求1所述抗菌肽的基因。3.权利要求1所述的抗菌肽或权利要求2所述的基因在制备抑菌剂中的应用。4.权利要求1所述的抗菌肽或权利要求2所述的基因在制备抗菌药物中的应用。5.根据权利要求3或4所述的应用，所述的抑菌剂或抗菌药物中的菌为枯草芽孢杆菌（B. subtilis），...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋沛，董五辈，
申请(专利权)人：权利要求书一页说明书六页序列表一页附图七页，
类型：发明
国别省市：