一种高亲和力抗丙型肝炎病毒的全人源单克隆抗体及其用途制造技术

本发明专利技术涉及一种高亲和力抗丙型肝炎病毒的全人源单克隆抗体及其用途，属于生物工程技术领域。所述的单克隆抗体或其片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示。本发明专利技术还提供该抗体的编码基因、表达载体、用途和组合物。本发明专利技术的结合分子能阻止丙型肝炎病毒侵染易感细胞，且是全人源的，与其它动物源性(如鼠源性)抗丙型肝炎病毒的分子相比，免疫原性低，且亲和性良好，不仅治疗效果好，而且副作用低，同时可靠的有效性及安全性也为此类抗体的标准化生产成药提供了很大的保障。的标准化生产成药提供了很大的保障。的标准化生产成药提供了很大的保障。

【技术实现步骤摘要】
一种高亲和力抗丙型肝炎病毒的全人源单克隆抗体及其用途


[0001]本专利技术涉及生物工程
，具体地说，涉及一种高亲和力抗丙型肝炎病毒的全人源单克隆抗体及其用途。

技术介绍

[0002]上世纪八十年代，研究人员第一次从黑猩猩的血液中分离出了一种区别于甲乙型的肝炎病毒，该病毒后被命名为丙肝病毒(HCV)。丙肝感染已经成为全球性的健康问题，不同性别、年龄、种族人群均对HCV易感。目前世界上感染HCV的患者据估计已经超过1.84亿人，通过血清阳性率估计的全球HCV感染率约为1.5％
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3.5％，而其中大多数HCV感染人群生活在亚洲东部和南部地区，两地区患病人数约5,000万人(总数超过1亿)。据估计，我国丙肝的患病率为1％，HCV携带者超过1000万以上，丙肝患者人数居世界排名第一位。
[0003]在全球范围内，由于HCV的高度变异和免疫逃逸机制，各地区的流行分布情况存在着较大差异。目前，全世界主要流行的丙肝病毒株主要分为11个基因型，70多种亚型，不同基因型的HCV病毒毒力不同，致病能力也有着很大差异。通过对我国29个省市的32030患者样本结果进行分析发现，我国主要流行的丙肝亚型为1b(n＝16 713，52.18％)，2a(n＝9188，28.69％)，3b(n＝2261，7.06％)，6a(n＝2052，6.41％)和3a(n＝1479，4.62％)，而在其他小部分样本中发现了主要亚型的混合感染，其组合如下：1b
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2a，1b
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3b，1b
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6a，3a
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3b，1b
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3a和2a
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6a，这些HCV基因亚型的分布与人群性别，年龄及所在的地理位置有着密切联系。
[0004]依照长期的临床实践经验和实验室技术的检测，丙肝的临床诊断标准可如下：临床表现为全身乏力、食欲减退，右季肋部不适，肝脾肿大等特点；实验室检查谷丙转氨酶、谷草转氨酶多呈轻度和中度升高，抗
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HCV抗体阳性，HCV RNA阳性；进一步结合患者病程持续时间长短及对应流行病学史的有无等进行诊断。
[0005]丙肝治疗主要目的是清除病毒，使HCV在体内的复制水平长期保持在极低的载量，充分减轻HCV感染造成的肝损伤病变等，提高患者的长期生存率，和生存质量。在长期的丙肝治疗中，临床上经典的治疗方法为干扰素合并利巴韦林，这类方法副作用较大，容易产生耐药性，对不同基因型患者效果差异较大。随着国际新型药物如盐酸达拉他韦片和阿舒瑞韦软胶囊这类直接抗病毒药物(Direct Anti
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virial Agents,DAAs)的问世，我国已经批准大部分DAAs在临床使用，DAA药物的主要作用机制为抑制HCV颗粒内的NS3/4A蛋白酶和NS5A/B聚合酶，在使用直接抗病毒药物之前，通过患者所感染的丙肝基因型进行鉴定，结合患者的肝脏损伤其其他情况，选择合适的抗病毒方案能够有效治疗HCV感染。在2018年，吉利德公司生产的“丙通沙”(索磷布韦维帕他韦片)正式进入我国药品目录，标志着丙肝治疗新时代的来临，这款全口服、泛基因型、单一片剂的丙肝治疗新药为患者带来福音，但其不可避免的耐药性和较高的价格令部分患者望而却步。
[0006]1975年，两位剑桥大学的研究者Milstein和首次专利技术杂交瘤技术，该技术原理是将免疫后的鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，在融合后筛选出能够稳定分泌单一型
抗体的杂交瘤细胞。同时，单克隆抗体的概念也因此而来，这种抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一，仅针对某一特定抗原表位的抗体,其具有纯度高、特异性强，交叉反应少等先进的优势特点。然而，由于此类方法生产的是鼠源性蛋白，对人体具有相当的免疫原性，无法满足长期治疗。随着，现代分子生物学和蛋白质工程技术的发展，该技术的局限性得到不同程度的解决。最初，研究人员通过人源的可结晶片段(Fragment crystallizable,Fc)序列取代大多数鼠源Fc序列，实现生产新型的“嵌合”抗体。之后，进一步通过生物工程改造，将鼠抗原结合区(Fragment of antigen binding,Fab)移植到人免疫球蛋白(IgG)骨架上，以提高单克隆抗体的人源化程度，如今成熟的技术已经能够生产出全人源的单克隆抗体。
[0007]目前，能够制备出全人源的单克隆抗体技术多样。主要有抗体库技术，如噬菌体展示抗体库技术和核糖体展示抗体库技术，单细胞克隆表达技术等。这些技术各有优劣，抗体库技术可在体外直接制备特异、稳定的单抗，然而前期的建库工作量十分庞大，所需的库容量需要囊括某种动物的抗体多样性，高通量的筛选往往只能获得抗体的部分片段，在后期无法保证抗体的高亲和力。单细胞克隆表达的方法是利用流式细胞仪分选得到某种特异性B细胞，通过基因技术分离其同源性抗体的重轻链可变区基因，从而在真核系统中表达。这种方法中，前期B细胞的分选尤为关键，需要高度特异并稳定的抗原作为探针，才能有效分选。
[0008]近十年来，单克隆抗体药物成为药物研发的热点。作为新型的大分子蛋白类药物，其具有特异性强，效果显著的优势，同时由于单抗药物的人源化水平较高，免疫原性相对较低，人体不易产生排斥反应，安全性也得到了极大的保障。随着单克隆抗体在肿瘤领域广泛应用，感染性疾病对应的单克隆抗体药物研发也在积极推进中，针对呼吸道合胞病毒感染的帕丽珠单抗，以及抗HIV感染的伊巴珠单抗相继问世，治疗丙肝的单克隆抗体药物虽然尚未问世。

技术实现思路

[0009]本专利技术人经过深入的研究，选取HCV表面具有良好免疫原性的E2蛋白作为抗原表位，通过从感染丙肝病毒病原体后康复人群的全血中提取记忆性B细胞，体外活化成浆细胞，采用某种特异性抗原筛选分泌有特异性抗体的浆细胞，再利用少量细胞RNA的高效提取和巢式PCR等技术筛选出特异性抗体基因。本专利技术的单克隆抗体是全人源的，其重链、轻链可变区以及恒定区均来源于人的基因，因此具有免疫原性低、安全性高的特点，试验结果证明，本专利技术的单克隆抗体具有高亲和力的特点，本专利技术提供的单克隆抗体能具有显著抗丙型肝炎病毒，为此类抗体的标准化生产成药提供了很大的保障。
[0010]HCV是一种较小有包膜的单链RNA病毒，基因组全长9.6kb。HCV颗粒由一个带5'和3'非翻译区(UTR)的正极性RNA基因组，以及一段编码近3000个氨基酸的蛋白前体的开放阅读框(ORF)组成。UTR构成高度保守的顺式作用RNA元件，可调节病毒基因组的翻译和复制。经由开放阅读框编码的蛋白前体组装加工后，主要形成10种结构及非结构蛋白(core，E1，E2，p7，NS2，NS3，NS4A，NS4B，NS5A和NS5B蛋白)。HCV颗粒的外包膜主要由E1和E2糖蛋白组成，这两种蛋白的编码区域分别位于HCV蛋白结构N端的残基192
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383位点(E1)和384
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746位点(E2)，作为高度糖基化的I型跨膜蛋白，它们能够结合形成非共价异二聚体结构，对于病本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高亲和力抗丙型肝炎病毒的全人源单克隆抗体，其特征在于，其具有如下重链可变区和轻链可变区：重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示。2.根据权利要求1所述的全人源单克隆抗体，其特征在于，所述抗体特异性结合丙肝病毒E2蛋白。3.编码如权利要求1所述单克隆抗体的核酸分子，其特征在于，其具有如下重链可变区和轻链可变区：重链可变区的核苷酸序列如S...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡萍，辛洪波，尧志峰，刘苏俊，张文华，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：