一种融合表达制备人甲状旁腺激素1-34的方法技术

本发明专利技术提供了一种融合表达制备人甲状旁腺激素1

【技术实现步骤摘要】
一种融合表达制备人甲状旁腺激素1
‑
34的方法


[0001]本专利技术涉及融合蛋白表达
，尤其涉及一种融合表达制备人甲状旁腺激素1
‑
34的方法。

技术介绍

[0002]甲状旁腺素(Parathyroid hormone,PTH)是由84个氨基酸组成的多肽激素，在体内甲状旁腺素由甲状旁腺上皮细胞合成、储存和分泌。甲状旁腺上皮细胞内转录的mRNA编码的前甲状旁腺素原(Pre
‑
pro
‑
PTH)，由115个氨基酸组成，在成熟PTH肽段氨基端还有23个氨基酸残基的信号多肽和6个氨基酸残基的激素原序列。信号多肽序列和激素原序列分别在内质网和高尔基体中被酶切成为84个氨基酸的PTH储存在细胞内，在低血钙信号的刺激下其释放，成为调节机体血钙浓度的主要因子。进入血循环的PTH又迅速转变成氨基端和羧基端二个肽段，其中PTH氨基端1
‑
34氨基酸残基肽段为PTH完整生物活性基团，调节血钙浓度及骨代谢，免疫活性小。
[0003]PTH对骨形成的影响，主要是通过作用于骨组织细胞和肾小管上皮细胞而产生的。对于肾小管上皮细胞，PTH主要增加远曲小管的钙的重吸收和通过增加肾脏产生有活性的维生素D间接促进肠道对钙的吸收，共同提高血钙浓度，有利于骨的形成。对于骨组织则既有促进骨吸收，又有促进骨形成作用。
[0004]第一种用于临床治疗骨质疏松症的hPTH的类似物是rhPTH1
‑
34(含有天然的PTH的N端的1
>‑
34个氨基酸序列的PTH类似物)，它于2002年11月获美国FDA批准，商品名特立帕肽，为注射剂，由美国礼来公司生产，主治绝经后妇女骨质疏松症和原发性骨质疏松症，已于2003年初在美国上市。这种药物具有与天然hPTH氨基末端34个氨基酸序列完全相同的结构。其生物学作用亦是通过与特异性、高亲和性受体hPTH
‑
1结合介导的。与天然的hPTH相比，它对骨和肾具有相同的生理作用，但克服了羧基末端对骨代谢的不利影响。
[0005]甲状旁腺功能减退症(HP)是一种罕见的内分泌疾病，其特征是甲状旁腺激素(PTH)水平不足，导致血液中钙含量低以及磷酸盐水平升高。在美国、欧洲、日本和韩国，大约有20万HP患者，大多数患者在甲状腺手术期间损伤或意外切除甲状旁腺后发生病情。在短期内，患者出现的症状包括：虚弱，肌肉痉挛，异常感觉，如刺痛、灼烧和麻木，记忆力丧失，判断失误和头痛。患者常常体验到生活质量的下降。长期来看，这种复杂的紊乱会增加主要并发症的风险，如骨骼外钙沉积，发生在脑内、眼晶状体和肾脏，其中钙在肾脏内沉积可能导致肾功能受损。直到最近，HP仍然是少数几种无激素替代疗法治疗的激素缺乏疾病之一。HP的常规标准护理疗法维生素D和钙补充剂并不能完全控制疾病，并可能因钙尿增加引起渐进性肾脏钙化和肾结石，导致肾脏疾病。其结果是，与健康人相比，HP患者发生肾脏疾病的风险高出4
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8倍。
[0006]2018年美国食品和药物管理局(FDA)已授予Ascendis制药公司实验性药物TransCon PTH治疗甲状旁腺功能减退症的孤儿药资格(ODD)，TransCon PTH是一种甲状旁腺激素(PTH[1
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34])的长效前药(prodrug)，采用Ascendis公司创新性的TransCon技术开
发。TransCon PTH旨在每天24小时恢复PTH至生理水平，使血液和尿液钙水平、血清磷酸盐水平、骨转换正常化，以解决该病的短期症状和长期并发症。
[0007]PTH1
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34作为骨质疏松症与甲状旁腺功能减退症的主要治疗用药，具有巨大的商业价值，因此高效且低成本的获得PTH1
‑
34是各个相关药物研发药企的首要目标。目前，人甲状旁腺素1
‑
34的制备方法可以用化学合成法和基因工程重组表达法。化学合成法生产成本高，产能受到限制。采用基因工程重组技术在原核细胞大肠杆菌中进行大规模的发酵表达，具有成本低、生产周期短等明显优势，是制备肽类蛋白质原料药最常用一种方法。
[0008]CN1807456A、CN112646826A都公布了一种融合表达制备PTH1
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34的方法，采用伴侣蛋白
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肠激酶融合表达PTH1
‑
34，前者为包涵体，后者为可溶性表达，虽然融合表达蛋白量较高，但经肠激酶酶切后得到的PTH1
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34仅占融合蛋白总量的20％，目的蛋白收率较低，此外，伴侣蛋白(Trx)适用于需要复性的大分子蛋白的融合表达，PTH1
‑
34本身空间结构简单，不需复性。

技术实现思路

[0009]针对现有技术中所存在的不足，本专利技术提供了一种融合表达制备人甲状旁腺激素1
‑
34的方法，其解决了现有技术中存在的目的蛋白收率低的问题。
[0010]本专利技术一方面，提供一种融合蛋白，由N端至C端包括胰高血糖素样肽和人甲状旁腺激素1
‑
34，其中，所述胰高血糖素样肽包括胰高血糖素样肽
‑
1及其类似物、胰高血糖素样肽
‑
2及其类似物中的一种或几种。
[0011]进一步地，所述胰高血糖素样肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2
‑
12所示；所述人甲状旁腺激素1
‑
34的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。
[0012]进一步地，所述融合蛋白的氨基酸序列通式为：
[0013]a+b
M
+(d+c)
N
，
[0014]其中，a为前导肽，b为胰高血糖素样肽，c为人甲状旁腺激素1
‑
34，d为连接肽，M、N为整数，M为1
‑
4，N为2
‑
8。
[0015]进一步地，所述前导肽包括标签序列和促表达序列，所述标签序列为重复的His序列，所述促表达序列包括5
‑
10个氨基酸，所述氨基酸包括丙氨酸、谷氨酸和甘氨酸中的一种或几种。
[0016]优选地，所述前导肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0017]进一步地，所述连接肽的氨基酸序列含有重组双碱性氨基酸内肽酶和羧肽酶B的酶切位点；
[0018]优选地，所述连接肽的氨基酸序列为KR或RK或RKR或KRK。
[0019]具体地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:14
‑
26所示。本专利技术具体实施例中，以SEQ ID NO:26为例进行具体说明，但可以理解地是，本专利技术中的任一种氨基酸序列的融合蛋白均具有同样的作用，达到同样的效果。
[0020]本专利技术又一方面，提供编码上述融合蛋白的基因。
[0021]本专利技术另一方面，提供包含上述基因的重组质粒或宿主细胞。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.融合蛋白，由N端至C端包括胰高血糖素样肽和人甲状旁腺激素1
‑
34，其中，所述胰高血糖素样肽包括胰高血糖素样肽
‑
1及其类似物、胰高血糖素样肽
‑
2及其类似物中的一种或几种。2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述胰高血糖素样肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2
‑
12所示；所述人甲状旁腺激素1
‑
34的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列通式为：a+b
M
+(d+c)
N
，其中，a为前导肽，b为胰高血糖素样肽，c为人甲状旁腺激素1
‑
34，d为连接肽，M、N为整数，M为1
‑
4，N为2
‑
8。4.如权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述前导肽包括标签序列和促表达序列，所述标签序列为重复的His序列，所述促表达序列包括5
‑
10个氨基酸，所述氨基酸包括丙氨酸、谷氨酸和甘氨酸中的一种或几种。5.如权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述前导肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。6.如权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述连接肽的氨基酸序列含有重组双碱性氨基酸内肽酶和羧肽酶B的酶切位点；...

【专利技术属性】
技术研发人员：冷国政，李虹庆，杨辉，陈清，潘武生，范开，
申请(专利权)人：重庆派金生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：