一种羰基还原酶突变体及其在制备R-扁桃酸中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种羰基还原酶突变体及其在R

【技术实现步骤摘要】
一种羰基还原酶突变体及其在制备R
‑
扁桃酸中的应用


[0001]本专利技术涉及生物合成
，具体涉及一种酶催化制备扁桃酸的方法。

技术介绍

[0002]扁桃酸(Mandelic acid,MA)，化学名称a
‑
羟基苯乙酸，CAS 90
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64
‑
2，化学式为C8H8O3，分子量152.15，熔点118
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121℃，易溶于水和乙醇。
[0003]手性扁桃酸是重要的氨基酸合成前体和药物中间体。R
‑
扁桃酸是合成青霉素、头孢拉定等抗生素的重要中间体，还可以用于合成抗肿瘤药物Goniothalamus styryllactones、治疗水肿和风湿疾病药物(+)
‑
CrassalactoneA，目前市场上对手性扁桃酸的需求远远大于对其外消旋体的需求，因而手性扁桃酸成为热点的精细化工中间体。
[0004]光学纯扁桃酸生产方法主要有物理化学方法、化学法和生物催化法。物理化学方法主要包括毛细管电泳法和色谱分离法。色谱法中主要有高效液相色谱法(HPLC)和气相色谱法(GC)。色谱法不能够实现手性扁桃酸工业化大规模生产。化学法生产手性扁桃酸主要分为非对映体盐结晶拆分法、不对称合成法和电化学法等。采用化学法生产具有反应条件苛刻，环境污染大的缺点。

技术实现思路

[0005]本专利技术目的是用易错PCR方法对羰基还原酶基因进行改造，使改造后羰基还原酶针对苯甲酰甲酸的酶活性有所提高，使其符合在催化生产R
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扁桃酸工业化应用的需求。
[0006]本专利技术采用的技术方案为：通过易错PCR方法随机引入突变碱基，经高通量筛选获得羰基还原酶突变体菌株。所述突变体是通过对来源于有害片球菌Pediococcus damnosus野生型羰基还原酶氨基酸序列(SEQ ID NO.2所示)引入随机突变获得。突变体序列第106位丙氨酸突变为亮氨酸。
[0007]本专利技术还涉及一种由所述羰基还原酶突变体构建的重组载体。
[0008]本专利技术提供一种由所述重组载体转化制备的重组基因工程菌。
[0009]本专利技术还提供一种所述羰基还原酶突变体在苯甲酰甲酸制备R
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扁桃酸中的应用。
[0010]进一步地，在上述应用中，以苯甲酰甲酸为底物和pH＝7.5PB缓冲液为反应介质，在含有羰基还原酶突变体的重组基因工程菌存在下，进行还原反应后得到R
‑
扁桃酸。
[0011]进一步地，在上述应用中，还原反应在水浴控温、磁力搅拌条件下进行。
[0012]进一步地，在上述应用中，酶源通过以含羰基还原酶突变体编码基因的重组工程菌经诱培养获得的菌液经裂解获得，所述酶源按如下方法制备：取不同突变体菌液以及未突变菌种18uL接种于1.8mL LB培养基(96孔板中预先加入1.8mL培养基)，同时加入2uL 100mg/mLKan溶液，37℃振荡培养至菌体浓度OD 600nm约为0.6
‑
0.8，15℃静置30min，之后加入2uL 200mg/mL IPTG溶液，16℃振荡诱导24h。使用96孔板离心机进行离心；离心后沉淀加0.2mL裂解液重悬，超声破碎，4℃，3000
×
g，10min离心，破碎上清保留，用于酶活分析。
[0013]突变体羰基还原酶KARase
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F106L(氨基酸序列为SEQ ID NO.3)的催化活力较野生
型酶活(17U/L)有显著提高，分别达到了60.5U/L。本专利技术实施例中转化率可高达到96％，R
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扁桃酸对映选择性达到100％ee，是一种全新环保节能、高效R
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扁桃酸的合成工艺。
具体实施方式
[0014]本专利技术中实验方法如无特别说明均为常规方法，基因克隆操作具体可参见J.萨姆布鲁克等编《分子克隆实验指南》。本专利技术所涉及表达酶基因的重组大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)，以及所用载体为pET
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30a购自TAKARA公司。下游催化工艺所用试剂：苯甲酰甲酸，购自阿拉丁化学试剂有限公司；其他常用试剂购自国药集团化学试剂有限公司。在本申请文本中所使用的氨基酸三字母或单字母表达方式，采用IUPAC规定的氨基酸代码(Eur.J.Biochem.,138:9
‑
37,1984)。
[0015]采用高效液相色谱(HPLC)检测过程中R
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扁桃酸生成，具体方法为：色谱仪为安捷伦1260；色谱柱为大赛璐Chiral OJ
‑
H(5μm,250mm
×
4.6mm,5μm)，流动相为正己烷
‑
乙醇
‑
三氟乙酸(96:4:0.3)，检测波长：220nm；流速：1.0mL/min；柱温：30℃。
[0016]一、构建野生型羰基还原酶基因重组表达菌株
[0017]委托北京擎科新业生物技术有限公司提供密码子优化和基因合成服务，来源于有害片球菌Pediococcus damnosus羰基还原酶(KARase)基因，基因序列如SEQ ID NO.1，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。将这一基因克隆于pET
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30a(+)质粒上的酶切位点EcoRI和HindIII之间，获得pET
‑
30a(+)
‑
KARase重组质粒。将重组质粒pET
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30a(+)
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KARase转染到宿主大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中获得重组基因工程菌E.coli BL21(DE3)
‑
pET
‑
30a(+)
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KARase。
[0018]使用LB培养基对基因工程菌E.coli BL21(DE3)
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pET
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30a(+)
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KARase进行活化与培养。
[0019]LB培养基具体配方：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，用去离子水溶解后定容，121℃灭菌20min，待用。固体培养基为LB培养基加入2％琼脂。
[0020]活化与培养方案：将保存有工程菌E.coli BL21(DE3)
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pET
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30a(+)
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KARase的甘油管划线至LB固体培养基(含有50μg/mL卡那霉素)平皿上，37℃静置培养12h。从平皿上挑取单菌落接入含50μg/mL卡那霉素5mL LB培养基中，37℃、200rpm培养12h。在获得培养液后，根据质粒提取试剂盒的操作说明书进行质粒的提取。
[0021]二、构建羰基还原酶基因突变体表达菌株
[0022]以步骤一中提取pET
‑
30a(+)
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种羰基还原酶突变体，其特征在于，该菌株羰基还原酶基因经测序突变位点为：将SEQ ID NO.2所示有害片球菌Pediococcus damnosus野生型氨基酸序列第106位丙氨酸突变为亮氨酸，突变体氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示。2.一种重组载体，其特征在于：采用权利要求1所述羰基还原酶突变体构建。3.一种重组基因工程菌，其特征在于：采用权利要求2所述重组载体转化制备。4.权利要求1所述羰基还原酶突变体在制备R
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扁桃酸中的应用。5.根据权利要求4所述羰基还原酶突变体在制备R
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扁桃酸中的应用，其特征在于：以苯甲酰甲酸为底物和pH＝7.5PB缓冲液为反应介质，在含有羰基还原酶突变体的重组基因工程菌存在下，进行还原反应后得到R
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扁桃酸。6.根据权利要求5所述羰基还原酶突变体在...

【专利技术属性】
技术研发人员：谷绪顶，李武威，马飞鸿，杜项龙，
申请(专利权)人：上海瀚鸿科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：