一种水溶性快速免疫佐剂及其制备方法技术

本发明专利技术提出了一种水溶性快速免疫佐剂包括7α,25

【技术实现步骤摘要】
一种水溶性快速免疫佐剂及其制备方法


[0001]本专利技术涉及免疫佐剂
，尤其涉及一种水溶性快速免疫佐剂及其制 备方法。

技术介绍

[0002]随着免疫学的飞速发展，人们开发出了多种基于抗原抗体反应的免疫学应 用，包括疫苗的开发使用、治疗性抗体药物的临床应用、科研原料及体外诊断 性试剂盒的生产等。这一系列的应用都离不开高亲和力、高滴度、高特异性抗 体的开发生产，而不管是传统的单多克隆抗体开发还是近年新发展出来的文库 展示技术都绕不开抗原免疫动物。因此，能否成功高效免疫动物成为各项应用 能否顺利实现的关键技术环节。得益于纯化层析技术的发展，人们通常能得到 高纯度且具备生物活性的抗原，但单独使用抗原免疫往往难以诱导机体产生有 效的免疫应答。解决这一关键问题的有效途径是使用佐剂。
[0003]传统动物免疫均采用经典弗氏佐剂混合抗原乳化后注射动物的方式，但是 该方法存在一些问题：抗原和油性佐剂混合需要进行乳化，乳化过程中不可避 免会破坏抗原天然构象，难以得到针对结构表位的抗体，同时乳化程度也难以 控制一致，造成免疫效果波动较大；完全佐剂中含有的卡介苗成分属于管控物， 难以获得，而且复杂的蛋白成分增加了免疫背景；弗氏完全佐剂可能导致注射 部位局部炎症和其他疾病。市面上陆续出现的新型佐剂往往针对佐剂安全性问 题做了一定改进，比如使用机体易于降解代谢的角鲨烯乳化，使用小分子物质 替代卡介苗作用，又或使用糖苷和脂质复合体增强抗原提呈。但这些佐剂对于 不同性质抗原常有不同适用性，免疫效果波动较大，无法有效维持抗原结构。 另外大部分佐剂对于同源性高或免疫原性低抗原免疫效果无帮助。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术提出了一种无需乳化，且不含白介苗或灭活的分歧杆菌 等含复杂蛋白的成分，免疫后不产生针对佐剂的抗体的水溶性快速免疫佐剂及 其制备方法。
[0005]本专利技术的技术方案是这样实现的：本专利技术提供了一种水溶性快速免疫佐剂， 其特征在于：包括7α,25
‑
OHC、环糊精、铝盐、壳聚糖基温敏水凝胶和去离子 水。
[0006]在以上技术方案的基础上，优选的，以1L佐剂配制为例，包括50
‑
500μg/mL 的7α,25
‑
OHC、1％
‑
3％的环糊精、1
‑
5mg/mL的铝盐、5％
‑
7％的壳聚糖基温敏水 凝胶，其余为去离子水。
[0007]在以上技术方案的基础上，优选的，所述壳聚糖基温敏水凝胶偶联有咪唑 喹啉。
[0008]在以上技术方案的基础上，优选的，所述咪唑喹啉为R848。
[0009]在以上技术方案的基础上，优选的，所述壳聚糖
‑
R848的制备方法包括如下 步骤：
[0010]S1，将壳聚糖粉末加入去离子水中，超声分散均匀，然后边搅拌边滴加乳 酸至壳聚糖完全溶解，加入溴乙酸调节pH 7
‑
7.5，在20
‑
30℃条件下反应2h，得 到羧基化壳聚糖；
[0011]S2，在羧基化壳聚糖中依次加入EDC、NHS和R848，在20
‑
30℃条件下反 应1
‑
1.5h，
然后将反应液置于4℃环境下，加入质量浓度为10.8％的β甘油磷酸 钠水溶液，混合均匀后得到偶联R848的壳聚糖基温敏水凝胶。
[0012]在以上技术方案的基础上，优选的，所述壳聚糖粉末的脱乙酰度为 75％
‑
99％，分子量为10kd
‑
500kd，粘度为30
‑
100cP，所述壳聚糖:去离子水的质 量比为(1
‑
2):100。
[0013]在以上技术方案的基础上，优选的，步骤S1所述壳聚糖:溴乙酸的摩尔比为 (1
‑
3):20。
[0014]在以上技术方案的基础上，优选的，步骤S2所述羧基化壳聚 糖:EDC:NHS:R848的摩尔比为500:(1
‑
2):(1
‑
3):25。
[0015]在以上技术方案的基础上，优选的，所述铝盐为氢氧化铝。
[0016]本专利技术还提供了一种水溶性快速免疫佐剂的制备方法，包括如下步骤：将 7α,25
‑
OHC、环糊精、铝盐和壳聚糖基温敏水凝胶溶于去离子水中，在1.23
×
105Pa 条件下蒸气灭菌30min，即得。
[0017]本专利技术水溶性快速免疫佐剂中的7α,25
‑
OHC作为趋化因子促进淋巴细胞向 抗原注射部位的迁移，环糊精作为该免疫佐剂稳定剂，铝盐促进抗原呈递；壳 聚糖
‑
R848是一种壳聚糖和R848通过氨基偶联的大分子，在将R848固定于抗 原注射部位持续发挥TLR激活作用的同时能起到缓释佐剂其它组份和抗原的作 用。相对于现有技术具有以下有益效果：
[0018](1)本专利技术的水溶性快速免疫佐剂不含白介苗或灭活的分歧杆菌等含复杂蛋 白的成分，免疫后不产生针对佐剂的抗体。同时，由于不含矿物油，本专利技术的 佐剂成分均为水溶性可降解吸收物质，组织损伤和应激反应小。
[0019](2)本专利技术的水溶性快速免疫佐剂为水溶性佐剂，不会导致疏水基团外翻， 保留抗原的天然构象，因此可以获得针对构象性表位的抗体。使用该水溶性快 速免疫佐剂混合抗原免疫，无需乳化，抗原和佐剂混匀后以水溶性方式直接注 射免疫，操作方便的同时避免了乳化过程中对抗原的破坏，更易得到针对结构 表位的抗体，相比传统弗氏佐剂和市面上的新型佐剂可产生更高的抗体血清效 价。
[0020](3)本专利技术的水溶性快速免疫佐剂可打破动物免疫耐受，对于同源性高的抗 原仍可制得滴度高、亲和力高的抗体。抗体制备使用本专利技术的水溶性快速免疫 佐剂仅需免疫2针，免疫针次少，且每针次抗原用量低至小鼠10
‑
20μg，兔 50
‑
100μg，有效降低了抗原使用量。抗体产生快，3
‑
5周即可成功得到抗体，相 比常规弗氏佐剂节省一半时间，大大提高实验效率，节省动物饲养成本。
附图说明
[0021]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施 例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述 中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付 出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0022]图1为本专利技术的水溶性快速免疫佐剂组分筛选各组免疫效果检测图；
[0023]图2为不同免疫佐剂对OVA免疫小鼠细胞免疫的影响图；
[0024]图3为不同免疫佐剂对OVA免疫小鼠体液免疫的影响图。
具体实施方式
[0025]下面将结合本专利技术实施方式，对本专利技术实施方式中的技术方案进行清楚、 完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种水溶性快速免疫佐剂，其特征在于：包括7α,25
‑
OHC、环糊精、铝盐、壳聚糖基温敏水凝胶和去离子水。2.如权利要求1所述的一种水溶性快速免疫佐剂，其特征在于：以1L佐剂配制为例，包括50
‑
500μg/mL的7α,25
‑
OHC、1％
‑
3％的环糊精、1
‑
5mg/mL的铝盐、5％
‑
7％的壳聚糖基温敏水凝胶，其余为去离子水。3.如权利要求2所述的一种水溶性快速免疫佐剂，其特征在于：所述壳聚糖基温敏水凝胶偶联有咪唑喹啉。4.如权利要求3所述的一种水溶性快速免疫佐剂，其特征在于：所述咪唑喹啉为R848。5.如权利要求4所述的一种水溶性快速免疫佐剂，其特征在于：所述壳聚糖
‑
R848的制备方法包括如下步骤：S1，将壳聚糖粉末加入去离子水中，超声分散均匀，然后边搅拌边滴加乳酸至壳聚糖完全溶解，加入溴乙酸调节pH 7
‑
7.5，在20
‑
30℃条件下反应2h，得到羧基化壳聚糖；S2，在羧基化壳聚糖中依次加入EDC、NHS和R848，在20
‑
30℃条件下反应1
‑
1.5h；然后...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴琦，孙秋菊，刘少华，
申请(专利权)人：武汉菲恩生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：