一种具有洗涤剂抗性的普鲁兰酶PulY103B及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种具有洗涤剂抗性的普鲁兰酶PulY103B，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其为Ⅰ型普鲁兰酶，具有洗涤剂抗性，能提高洗涤剂或去污剂的清洗能力，本发明专利技术为洗涤剂的增效提供了新的途径，且本发明专利技术普鲁兰酶PulY103B制备简单，适用于工业化生产和市场推广应用。广应用。广应用。

【技术实现步骤摘要】
一种具有洗涤剂抗性的普鲁兰酶PulY103B及其应用


[0001]本专利技术属于基因工程和酶工程
，具体涉及一种来源于巨大芽孢杆菌的具有洗涤剂抗性的普鲁兰酶PulY103B及其应用。

技术介绍

[0002]淀粉是植物光合作用的产物，其结构中包含直链淀粉和支链淀粉，作为最原始的贮能物质，淀粉是很重要的多糖，是食品工业中必不可少的原材料。然而由于淀粉中支链淀粉含有约4%~5%的α
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1,6
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糖苷键，单一使用α
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淀粉酶（水解α
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1,4糖苷键）无法彻底水解淀粉，影响了淀粉水解度的提高。
[0003]普鲁兰酶是一类淀粉脱支酶，能够专一性水解糖原和支链淀粉分支点中的α
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1,6
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糖苷键，切下支链淀粉的整个侧链将其变成直链淀粉。根据水解位点的不同，可将普鲁兰酶分为两种类型，一种是Ⅰ型普鲁兰酶，专一性水解α
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1,6
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糖苷键；另一种是Ⅱ型普鲁兰酶，其同时具有水解α
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1,6
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糖苷键和内切多糖α
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1,4
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糖苷键的能力。普鲁兰酶主要应用于食品行业中，同时在环保、医疗及洗涤行业中也有重要的应用。
[0004]因为淀粉的糖化反应过程需要在较高温度（50~60℃）、酸性条件（pH4.5~5.5）下进行，目前报道的普鲁兰酶大都是以耐酸耐热为研究热点，而对于在洗涤剂工业中具有重要应用价值的碱性普鲁兰酶研究报道很少，一般来说，只有那些具有碱稳定性和洗涤剂抗性的普鲁兰酶才能用于洗涤剂行业，目前已报道的碱性耐受的普鲁兰酶中，还未具有优良洗涤剂抗性的酶出现，而没有此类特性，其活性会在洗涤剂中或在工作环境中很快失活，其功能特性很难得到体现，所以直至目前还未有成功商业化的洗涤剂适用普鲁兰酶。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了一种来源于巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）Y103的具有洗涤剂抗性的碱性稳定的普鲁兰酶PulY103B，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，该普鲁兰酶为Ⅰ型普鲁兰酶。
[0006]所述巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）Y103在本专利技术申请日之前已经在非专利文献中公开过，申请人保证从申请日起二十年内向公众发放生物材料。
[0007]本专利技术另一目的是将上述具有洗涤剂抗性的普鲁兰酶PulY103B应用在作为洗涤剂添加剂或去污剂添加剂中，该普鲁兰酶PulY103B具有洗涤剂抗性，能提高洗涤剂或去污剂的去污能力。
[0008]为了实现本专利技术的上述目的，本专利技术提供了如下的技术方案：1、从巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）Y103提取基因组DNA，以其DNA为模板，采用引物Pul
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F：GGAATTCCATATGACTGGTGATAATAAGTTTCAGG和Pul
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R：CCGCTCGAG CGTTTGAAATAAAATAAGAA克隆普鲁兰酶基因pulY103B，构建重组质粒PulY103B
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PET23b，构建重组菌株Pul Y103B
‑ꢀ
pET23b
‑ꢀ
E. coli BL21（DE3），进行重组蛋白Pul Y103B异源表达；通过Ni
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IDA亲和层析进行蛋白纯化，获得普鲁兰酶PulY103B；
2、普鲁兰酶PulY103B的活性分析本专利技术普鲁兰酶PulY103B的最适反应pH为6.5，最适反应温度为40℃，在30℃下能发挥70%以上的酶活力，且具有良好的碱稳定性，在pH 6.0
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8.5范围内呈现出较好的稳定性，该普鲁兰酶能水解普鲁兰糖、可溶性淀粉、支链淀粉、马铃薯淀粉、小麦淀粉和红薯淀粉；其具有洗涤剂抗性，质量浓度10% Tween 20、质量浓度10% Triton X
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100、质量浓度1%的Tween 80对普鲁兰酶PulY103B的酶活力具有明显的促进作用，酶活提高超过100%；蓝月亮、Ariel、Comfort、OMO和Tide五种商用洗涤剂在浓度3.0g/L下对普鲁兰酶PulY103B的酶活力具有促进作用。
[0009]本专利技术的优点和技术效果：本专利技术提供了一种新的普鲁兰酶，其为Ⅰ型普鲁兰酶，具有洗涤剂抗性，能提高洗涤剂或去污剂的清洗能力，本专利技术为洗涤剂的增效提供了新的途径，且本专利技术普鲁兰酶PulY103B制备简单，适用于工业化生产和市场推广应用。
附图说明
[0010]图1为普鲁兰酶PulY103B纯化图，其中泳道 M：高分子量蛋白标品；泳道1：裂解液；泳道2：电泳纯PulY103B；图2为普鲁兰酶PulY103B最适pH和pH稳定性的测定结果，其中图A为最适反应pH；图B为pH稳定性（
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为磷酸氢二钠
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柠檬酸缓冲液；
■
为磷酸氢二钠
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磷酸二氢钠缓冲液；
△
为3
‑
（N
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吗啉基）丙磺酸缓冲液；
●
为甘氨酸缓冲液）；图3为普鲁兰酶PulY103B最适温度及热稳定性测定，其中图A为最适反应温度；图B为温度稳定性结果；图4为普鲁兰酶PulY103B水解产物，其中图A：普鲁兰糖水解产物薄层层析图；图B：可溶性淀粉水解产物薄层层析图；图C：支链淀粉水解产物薄层层析图；图中泳道M：M1
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M7 （M1，葡萄糖； M2，麦芽糖；M3，麦芽三糖；M4，麦芽四糖；M5，麦芽五糖；M6，麦芽六糖；M7，麦芽七糖；IM6，异麦芽六糖）；图5为普鲁兰酶PulY103B水解普鲁兰糖的产物结果示意图，其中A图为麦芽寡糖标品高效液相色谱图；B图为普鲁兰糖产物高效液相色谱图；图6为普鲁兰酶PulY103B作为洗涤用酶洗涤效果图，其中A、污布；B、清水洗涤效果；C、蓝月亮洗衣液洗涤效果；D
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H、蓝月亮洗衣液中添加不同用量（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5U/mL）普鲁兰酶PulY103洗涤后效果。
具体实施方式
[0011]下面通过实施例对本专利技术作进一步详细说明，但本专利技术的内容并不局限于此，本实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明的均采用常规试剂或按常规方法配置的试剂。
[0012]下述实施例中人工淀粉污布的制作参照国标GB/T 13174
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2008中的方法，对商业白布进行染色；染色液是蛋白质
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油脂溶液与淀粉溶液等体积混合制得。蛋白质
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油脂溶液为含有10.0g/L阿拉伯树胶、1%（v/v）碳墨、60.0g/L全脂奶粉、10.0g/L全脂鸡蛋汁（蛋清/蛋黄=3/2）、5%（v/v）大豆油的水溶液。淀粉溶液为含20.0g/L小麦本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有洗涤剂抗性的普鲁兰酶PulY103B，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.一种编码权利要求1所述的普鲁兰酶PulY103B的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩鹏，吴昕尧，吴永民，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：