捕获磁珠介导的单颗粒中核酸靶标的分子条形码编码及用于其的组合物制造技术

本发明专利技术的实施方案提供了捕获磁珠介导对颗粒，例如细胞或细胞外囊泡的核酸靶标进行分子条形码编码的方法。所述方法包括以下方面：a)将包含颗粒的样品与包含用于颗粒的捕获部分的捕获磁珠组合，以产生捕获样品；b)使用施加磁场介导的划分方案对捕获样品的捕获颗粒进行划分，以产生划分的捕获颗粒，其中划分的捕获颗粒在空间上接近于包含靶标结合区的珠结合的条形码核酸；以及c)裂解划分的捕获颗粒，使得从中释放的核酸结合到靶标结合区以产生捕获的核酸。还提供了组合物，例如捕获磁珠，包括带条形码的磁珠，以及用于实施本方法的实施方案的装置/系统和试剂盒。施方案的装置/系统和试剂盒。施方案的装置/系统和试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】捕获磁珠介导的单颗粒中核酸靶标的分子条形码编码及用于其的组合物
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]根据35 U.S.C.
§
119(e)，本申请要求于2019年12月4日提交的美国临时专利申请序列第62/943647号的申请日期的优先权。该申请的公开内容通过引用并入本文。

技术介绍

[0003]检测和定量单个细胞中特异性核酸和蛋白质分子的能力对于理解细胞多样性在发育、健康和疾病中的作用至关重要。流式细胞仪已成为高通量检测单细胞蛋白标志物的标准技术，并已广泛应用于基础研究和临床诊断。相比之下，例如mRNA表达之类的核酸测量方法，通常在大量样品上进行，从而掩盖了单个细胞的贡献。
[0004]为了表征细胞系统的复杂性，非常需要开发用于监测在成千上万个细胞中大量基因的表达的方法、装置和系统。当前的技术允许以大规模并行方式(例如，>10000个细胞)测量单细胞的基因表达，通过将细胞特异性寡聚核苷酸条形码连接到来自单个细胞的多聚(A)mRNA分子上，其中每个单个细胞在分隔间与条形码试剂珠共定位。
[0005]除细胞外，人们对检测细胞外囊泡中的核酸，例如外泌体和微囊泡越来越感兴趣。细胞外囊泡，例如外泌体和微囊泡，几乎从所有细胞类型脱落，广泛分布于血液和其他体液中。多个研究报告已经证明，包埋在EV内的各种RNA类型(包括mRNA、miRNA和lncRNA)可以从供体细胞转移到受体细胞，并干扰后者的基因表达。Turchinovich等人，“Trascriptome of Extracellular Vesicles:Sate
‑
of
‑
the
‑
Art,”Front Immunol.(2019)10:202。因此，细胞外囊泡核酸的特征是令人感兴趣的。

技术实现思路

[0006]尽管当前技术允许以大规模并行方式(例如，>10000个细胞)测量单细胞的基因表达，但是专利技术人已经识别到迄今为止使用的方法的某些不足之处。例如，目前使用的平台可能很难划分具有低沉降率的小细胞和囊泡。此外，目前使用的平台可能对很多不感兴趣的细胞进行条形码编码和测序，导致资源使用效率低下。本专利技术的实施方案解决了这些和其他需求。
[0007]本专利技术的实施方案提供了捕获磁珠介导的对例如细胞或细胞外囊泡之类的颗粒的核酸靶标进行分子条形码编码的方法。所述方法包括以下方面：a)将包含颗粒的样品与包含用于颗粒的捕获部分的捕获磁珠组合，以产生捕获样品；b)使用施加磁场介导的划分方案对捕获样品的捕获颗粒进行划分，以产生划分的捕获颗粒，其中划分的捕获颗粒在空间上接近于包含靶标结合区的珠结合的条形码核酸；以及c)裂解划分的捕获颗粒，使得从中释放的核酸结合到靶标结合区以产生捕获的核酸。还提供了组合物，例如，捕获磁珠，包含带条形码的磁珠，以及用于实施本方法的实施方案的装置/系统和试剂盒。
[0008]本文提供了对颗粒的核酸进行条形码编码的方法。所述方法包括以下方面：a)将样品与包含用于样品颗粒的捕获部分的捕获磁珠组合，以产生捕获样品；b)使用施加磁场
介导的划分方案划分捕获样品的捕获颗粒以产生划分的捕获颗粒，其中划分的捕获颗粒在空间上接近于包含靶标结合区的珠结合的条形码核酸，例如，寡聚dT域、基因特异性域或随机序列域；以及c)裂解划分的捕获颗粒，使得从中释放的核酸结合到结合了条形码核酸的珠的靶标结合区以产生捕获的核酸。在一些情况下，珠结合的条形码核酸被拴系在捕获磁珠上，而在其他情况下，连接条形码核酸的珠被拴系在与捕获磁珠不同的带条形码的珠上。在一些情况下，划分的颗粒被划分到微孔中。在一些情况下，捕获部分包含特异性结合成员，例如抗体或其结合片段。在一些情况下，除了靶标结合区外，珠结合的条形码核酸还包含一个或多于一个细胞标记域、独特独特分子索引域和通用引物结合域，例如，其中结合条形码核酸的珠具有以下结构：珠
‑5’‑
通用引物结合域
‑
细胞标记域
‑
独特独特分子索引域
‑
靶标结合区
‑3’
。方法可以用于对来自多种颗粒的核酸进行条形码编码，例如生物颗粒、例如，细胞以及亚细胞大小的颗粒，例如，胞外囊泡、血小板、囊泡，例如外泌体或微囊泡。在一些情况下，方法还包括例如，通过使用施加磁场将捕获的核酸与划分的捕获颗粒的其他成分分离。在一些情况下，方法还包含混合捕获的核酸。在一些情况下，方法还包含将捕获的核酸置于cDNA合成反应条件下，以产生包含捕获的核酸的第一链cDNA域。在一些情况下，方法还包含从包含捕获的核酸的第一链cDNA域中产生扩增子组合物。在一些情况下，例如在其中扩增子组合物包含下一代测序(NGS)文库的实施方案中，使用一轮或多于一轮扩增从包含捕获的核酸的第一链cDNA域产生扩增子组合物。在一些情况下，扩增子组合物包含含有核酸的NGS衔接子。在一些情况下，该方法还包括对NGS文库进行测序。
[0009]在一些情况下，方法包括：a)将包含颗粒的样品与捕获磁珠组合，所述捕获磁珠包含：i)包含靶标结合区的条形码核酸，以及ii)与颗粒特异性结合的捕获部分，以产生捕获样品；b)使用施加磁场介导的划分方案将捕获样品的捕获颗粒划分至微孔中，以产生划分的捕获颗粒；裂解划分的捕获颗粒，使得从中释放的核酸结合到条形码核酸的靶标结合区以产生捕获的核酸；将捕获的核酸置于cDNA合成反应的条件下，以产生包含捕获的核酸的第一链cDNA域；从包含捕获的核酸的第一链cDNA域构建NGS文库；以及对NGS文库进行测序，从而对靶标颗粒的核酸进行测序。
[0010]在一些情况下，该方法还包括使用寡聚核苷酸标记的细胞组分结合试剂，例如，在其中需要检测例如定量分析一种或多于一种细胞组分，例如，表面蛋白的应用中。这种实施方案中使用的寡聚核苷酸标记的细胞组分结合试剂包括与细胞组分结合试剂特异性寡聚核苷酸偶联的细胞组分结合试剂，例如，抗体或其结合片段，所述细胞组分结合试剂特异性寡聚核苷酸包含用于细胞组分结合试剂的标识符序列，标识符序列与细胞组分结合试剂特异性寡聚核苷酸相关。在这种情况下，捕获磁珠可以包括配置为捕获，例如，特异性结合细胞组分结合试剂特异性寡聚核苷酸域。通过这种方式，可以结合基因表达分析蛋白表达，例如，在需要进行多组学分析时，例如转录组和蛋白质组的组合分析。
[0011]还提供了可用于该方法的实施方案的捕获磁珠。捕获磁珠的实施方案包括具有与磁珠稳定结合的条形码核酸的磁珠以及与颗粒特异性结合的捕获部分。在一些情况下，捕获部分包含抗体或其结合片段。在一些情况下，条形码核酸除了靶标结合区(例如，寡聚dT域、基因特异性域或随机序列域)外，还包括一个或多于一个细胞标记域、独特分子索引域和通用引物结合域，例如，其中珠结合的条形码核酸具有以下结构：珠
‑5’‑
通用引物结合域
‑
细胞标记域
‑
独特分子索引域
‑
靶标结合区
‑3’
本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种对颗粒的核酸进行条形码编码的方法，所述方法包括：a)将样品与包含用于样品颗粒的捕获部分的捕获磁珠组合，以产生捕获样品；b)使用施加磁场介导的划分方案对捕获样品的捕获颗粒进行划分，以产生划分的捕获颗粒，其中划分的捕获颗粒在空间上接近于包含靶标结合区的珠结合的条形码核酸；以及c)裂解划分的捕获颗粒，使得从中释放的核酸结合到珠结合的条形码核酸的靶标结合区以产生捕获的核酸。2.根据权利要求1所述的方法，其中珠结合的条形码核酸被拴系在捕获磁珠上。3.根据权利要求1所述的方法，其中珠结合的条形码核酸被拴系在与捕获磁珠不同的带条形码的珠上。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中划分的捕获颗粒被划分到微孔中。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中捕获部分包含特异性结合成员。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中珠结合的条形码核酸还包含细胞标记域、独特分子索引域和通用引物结合域。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中靶标结合区包含寡聚dT域、基因特异性域或随机序列域。8.根据前述权利要求中任...

【专利技术属性】
技术研发人员：菲利普，
申请(专利权)人：贝克顿，
类型：发明
国别省市：