高产L-苏氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术提供一种高产L

【技术实现步骤摘要】
高产L
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苏氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体地说，涉及一种高产L
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苏氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]L
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苏氨酸是人和动物生长必需的8种氨基酸之一，其广泛应用于饲料、食品添加及药物辅助材料制备等。目前L
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苏氨酸主要通过微生物发酵生产，多种细菌可用于L
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苏氨酸生产，如大肠杆菌、棒状杆菌属、沙雷氏菌属等的野生型诱导获得的突变株作为生产菌株。具体实例包括抗氨基酸类似物突变株或甲硫氨酸、赖氨酸、异亮氨酸等多种营养缺陷型。然而，传统诱变育种由于随机突变造成菌株生长缓慢及产生较多副产物，不易获得高产菌株。
[0003]随着全球苏氨酸需求量的不断增加，高产苏氨酸菌株的构建和改造尤为重要。2003年韩国CJ株式会社申请的中国专利CN03811059.8中，利用大肠杆菌，通过缺失苏氨酸操纵子序列的第
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56至
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18位的39bp序列，增强苏氨酸合成关键基因thrABC表达，苏氨酸生产力提高22％。Kwang Ho Lee(Kwang Ho Lee等,Systems metabolic engineering of Escherichia coli for L
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threonine production,Mol Syst Biol.2007；3:149)等利用系统代谢工程策略，通过突变编码天冬氨酸激酶I和III的基因thrA、lysC解除产物反馈抑制，通过敲除tdh及弱化ilvA来去除副产物甘氨酸、异亮氨酸，通过失活竞争途径基因metA和lysA为苏氨酸合成提供了更多前体等，最终获得的TH28C(pBRThrABCR3)菌株发酵50h可产酸82.4g/L，糖酸转化率39.3％。2016年梅花集团申请的中国专利ZL201611250306.8中，通过强化pntAB基因和异源引入pyc基因获得MHZ
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2菌株，该菌株苏氨酸产量为12.4g/L、转化率约为16.2％且无质粒负担。其中icd基因编码异柠檬酸脱氢酶IDH，IDH大多以同源二聚体存在，每个亚基有一个活性中心，两个结合位点。IDH是细菌TCA循环的限速酶，对其能量和物质代谢的调节具有重要作用，其反应为催化异柠檬酸氧化脱羧生成α
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酮戊二酸及CO2。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种高产L
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苏氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用。
[0005]为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种提高L
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苏氨酸发酵产量的方法，所述方法包括弱化发酵菌种中异柠檬酸脱氢酶基因或者与异柠檬酸脱氢酶的氨基酸序列具有80％以上同源性且表达相同功能蛋白的编码基因；所述发酵菌种为具有苏氨酸生产能力的细菌。
[0006]进一步地，所述细菌为埃希氏菌属(Escherichia)或棒杆菌属(Corynebacterium)菌种，优选大肠杆菌(Escherichia coli)或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，更优选菌株MHZ
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2，其保藏编号为CGMCC No.13403。参见ZL201611250306.8；更优选谷氨酸棒状杆菌SMCT033。
[0007]菌株SMCT033按照谷棒经典方法(C.glutamicum Handbook,Charpter 23)构建得
到，以谷氨酸棒状杆菌ATCC13032作为出发菌株，通过解除lysC基因反馈抑制并强化其表达，hom、thrB解除反馈抑制并强化其表达，强化thrC基因的表达，失活pck、pyk基因。其中，lysC、hom、thrB、thrC、pck、pyk在NCBI上的参考序列编号分别为1021294、1019166、1019167、1020172、1020806、1020040。
[0008]第二方面，本专利技术提供高产L
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苏氨酸的基因工程菌的构建方法，所述方法包括弱化或失活大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌中异柠檬酸脱氢酶基因，并将获得的基因弱化菌株用于苏氨酸发酵生产。
[0009]其中，大肠杆菌异柠檬酸脱氢酶基因(icd)在NCBI上的参考序列编号为U00096.3NC_000913.3(1195123..1196373)，Gene ID：945702。
[0010]谷氨酸棒状杆菌异柠檬酸脱氢酶基因在NCBI上的Gene ID：1018663。
[0011]所述弱化或失活可选自异柠檬酸脱氢酶基因的起始密码子弱化、启动子弱化、RBS序列弱化或失活等方式中的至少一种。
[0012]优选地，起始密码子弱化是用TTG替换异柠檬酸脱氢酶基因的起始密码子ATG。
[0013]优选地，启动子弱化是用弱启动子替换异柠檬酸脱氢酶基因的启动子。
[0014]优选地，RBS序列弱化是用可被苏氨酸调控的RBS序列替换异柠檬酸脱氢酶基因的RBS序列。
[0015]前述的方法，所述大肠杆菌为菌株MHZ
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2。
[0016]所述谷氨酸棒状杆菌为菌株SMCT033。
[0017]在本专利技术的一个具体实施方式中，高产L
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苏氨酸的基因工程菌的构建方法包括以下步骤：
[0018]A、pTargetF
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N20(icd)质粒及Donor DNA
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1的构建
[0019]A1：以pTargetF质粒为模板，用pTF
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sgRNA
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F1/pTF
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sgRNA
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R1引物对，扩增出带有N20的pTF线性质粒，使用无缝组装ClonExpress试剂盒将此线性质粒37℃进行组装，随后转化Trans1
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T1感受态细胞，获得pTargetF
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N20(icd)质粒，并进行PCR鉴定及测序验证；A2：以W3110基因组为模板，用icd
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UF/icd
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UR引物对，扩增出icd的上游同源臂
①
；A3：以W3110基因组为模板，选用icd
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DF/icd
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DR引物对，扩增出icd的下游同源臂
②
；A4：以
①
、
②
为模板，用icd
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UF/icd
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DR引物对，扩增出up
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icd
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down片段，也称Donor DNA
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1；
[0020]B、感受态细胞制备及电转化
[0021]B1：将pCas质粒电转入MHZ<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高L
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苏氨酸发酵产量的方法，其特征在于，所述方法包括弱化或失活发酵菌种中异柠檬酸脱氢酶基因或者与异柠檬酸脱氢酶的氨基酸序列具有80％以上同源性且表达相同功能蛋白的编码基因；所述发酵菌种为具有苏氨酸生产能力的细菌。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细菌为埃希氏菌属(Escherichia)菌种或棒杆菌属(Corynebacterium)菌种。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述细菌为大肠杆菌(Escherichia coli)或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。4.高产L
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苏氨酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述方法包括弱化或失活大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌中异柠檬酸脱氢酶基因，并将获得的基因弱化或失活菌株用于L
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苏氨酸发酵生产；大肠杆菌异柠檬酸脱氢酶基因在NCBI上的Gene ID：945702；谷氨酸棒状杆菌异柠檬酸脱氢酶基因在NCBI上的GeneID：1018663。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述弱化或失活选自异柠檬酸脱氢酶基因的起始密码子弱化、启动子弱化、RBS序列弱化或失活中的至少一种。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，起...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹春筱，刘慧敏，康培，
申请(专利权)人：廊坊梅花生物技术开发有限公司，
类型：发明
国别省市：