一种固定化模板多核苷酸配对末端测序方法技术

本发明专利技术涉及基因测序技术领域，具体涉及一种固定化模板多核苷酸配对末端测序方法。本发明专利技术方法中第一端测序模板链固定化在芯片上，通过将第一端测序模板链的互补链直接连接在其3

【技术实现步骤摘要】
一种固定化模板多核苷酸配对末端测序方法


[0001]本专利技术涉及基因测序
，具体涉及一种固定化模板多核苷酸配对末端测序方法。

技术介绍

[0002]配对末端测序允许确定来自一条多核苷酸双链两个位置的序列的两个读取，由于配对末端序列并非是完全随机的，而是已知发生在单个双链上，在基因组中是相连或成对的，有助于将全基因组的序列组合成一致的序列，提高一次测序获得的序列信息的长度。
[0003]现有技术中公开的基于阵列多核苷酸模板的配对末端测序方法包括，WO2004/070005中公开的在固体支持物上实施的，将两个或多个引物同时与靶多核苷酸杂交，在杂交步骤之后，除一个引物之外，封闭其他所有与模板杂交的引物，未被封闭的引物进行延伸测序，完成测序之后，被封闭引物中的一个解除封闭以得到游离3
’
羟基进行另一个延伸测序反应。该方法实施过程中虽然阵列的多核苷酸模板始终连接在固体支持物上，保持多核苷酸模板链的稳定性，但是必须要确保只有一个引物可延伸，其他引物必须完全封闭，在实际操作过程中很难确保其他引物的完全封闭，导致高的测序错误率；
[0004]WO2007010252公开了在固体支持物上形成双链模板簇，将双链模板簇变性形成单链簇，去除部分双链模板簇的其中一条链，对剩余的一条链进行测序；完成一次测序后，对剩余部分双模板簇中的与一次测序中序列相同的单链模板去除，对剩余的与该去除的模板链互补的链进行测序，完成双链模板的双末端测序。该方法一次只能对一部分簇的一条链进行测序，不能完全利用所有的簇，导致测序信号强度达不到预期；
[0005]WO2008041002公开了首先对全部的双链模板簇的其中一条链去除，对剩余的链测序，然后再以剩余的链为模板扩增形成其互补链，对其互补链进行测序，最终实现双末端测序。该方法需要首先形成第一端测序的模板链簇，然后再以第一端测序的模板链为模板扩增形成其互补链的簇作为第二段测序的模板，由于成簇的过程存在一定的无序性，该方法第二端测序的二次成簇过程会增加簇形成的无序性，使第二端测序的簇范围变大，增加簇信号校正的复杂性。因此，需要对现有的配对末端测序方法进一步创新改进，在确保第二端测序稳定性的同时，避免第二端测序的簇范围变大，降低簇信号校正的复杂性。

技术实现思路

[0006]为了克服现有技术的缺陷，本专利技术的目的之一是提供一种固定化多核苷酸模板配对末端测序方法，提高第二端测序的稳定性，降低簇信号校正的复杂性，提高测序质量。
[0007]同时，本专利技术还在于提供一种实施本专利技术测序方法的试剂盒。
[0008]为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：
[0009]一种固定化多核苷酸模板配对末端测序方法，包括以下操作步骤：
[0010]S1、提供固定在固体支持物上的阵列的单链模板多核苷酸簇，作为第一端测序模板链，加入第一测序引物，对单链模板多核苷酸至少部分序列进行测序，获得第一测序引物
的延伸链和对应的第一末端序列信息；
[0011]S2：以第一端测序模板链为模板，形成与第一端测序模板链全长互补的多核苷酸链，称为互补链；
[0012]S3：第一端测序模板链的3
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端与互补链的5
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端连接，解除第一端测序模板链和互补链的双链杂交结构，并封闭第一端测序模板链，阻止复性环境下互补链与第一端测序模板链重新杂交；
[0013]S4：加入与互补链的3
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端互补配对的第二测序引物，对互补链的至少部分序列进行测序，获得第二末端序列信息。
[0014]可选的，步骤S2中形成互补链的具体方法为将完成第一端测序的第一测序引物的延伸多核苷酸链继续以第一端测序模板链为模板延伸，形成与第一端测序模板链全长互补的多核苷酸链。
[0015]或者可选的，步骤S2中形成互补链的具体方法为，在变性条件下，将第一测序引物的延伸链与第一端测序模板链解除双链结构，去除第一测序引物的延伸链，加入至少部分与第一端测序模板链的3
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端互补的扩增引物，以第一端测序模板链为模板，延伸扩增引物形成与第一端测序模板链全长互补的多核苷酸链。
[0016]可选的，步骤S3中解除第一端测序模板链和互补链的双链杂交结构，并封闭第一端测序模板链的方法为：在变性条件下，第一端测序模板链和互补链解除双链杂交结构，形成长单链，之后加入仅与长单链的第一端测序模板链的3
’
端互补配对的第一延伸引物，第一延伸引物以第一端测序模板链为模板延伸形成与第一端测序模板链互补杂交的第一延伸引物链，封闭第一端测序模板链。
[0017]进一步优选的，在形成长单链之后，加入单链结合蛋白，之后再加入仅与长单链的第一端测序模板链的3
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端互补配对的第一延伸引物。
[0018]引物延伸环境下互补链存在与模板链杂交的可能性，为了避免互补链与模板链的复性杂交，通过控制簇密度与第一延伸引物的浓度关系或者第一延伸引物进行化学修饰。控制第一延伸引物的延伸速率大于互补链与模板链的复性杂交速率，利用动力学排除原理降低互补链与模板链复性杂交的可能性，提高利用互补链进行第二端测序的可行性和准确性。
[0019]可选的，步骤S3中解除第一端测序模板链和互补链的双链杂交结构，并封闭第一端测序模板链的方法为：加入与第一端测序模板链的3
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端互补配对的第二延伸引物，在链置换反应的环境下，第二延伸引物以第一端测序模板链为模板延伸，同时置换出与第一端测序模板链杂交的互补链，第二延伸引物形成的与第一端测序模板链互补配对杂交的第二延伸引物链，封闭第一端测序模板链。进一步可选的，通过重组酶将第二延伸引物与第一端测序模板链的3
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端互补杂交，在链置换环境下延伸第二延伸引物同时置换出与第一端测序模板链杂交的互补链；同时应当可以理解的是，在不使用重组酶的情况下，通过在第一端测序模板链的3
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端预留单链区域，第二延伸引物与该单链区域互补杂交，在链置换环境下延伸第二延伸引物同样能够置换出与第一端测序模板链杂交的互补链。
[0020]可选的，步骤S3中第一端测序模板链的3
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端与互补链的5
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端连接的方法为：在第一端测序模板链的3
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末端形成第一官能团，互补链的5
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末端形成第二官能团，引发第一官能团和第二官能团发生点击化学反应，将第一测序模板链的3
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端与互补链的5
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端共价连
接。
[0021]可选的，在第一端测序模板链的3
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末端形成第一官能团的方法包括采用末端转移酶将3
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修饰有第一官能团的修饰核苷酸连接在第一测序模板链的3
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末端；
[0022]互补链的5
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末端形成第二官能团的方法包括采用5
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末端修饰有第二官能团的引物，以第一端测序模板本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种固定化多核苷酸模板配对末端测序方法，其特征在于，包括以下操作步骤：S1、提供固定在固体支持物上的阵列的单链模板多核苷酸，作为第一端测序模板链，加入第一测序引物，对单链模板多核苷酸至少部分序列进行测序，获得第一测序引物的延伸链和对应的第一末端序列信息；S2：以第一端测序模板链为模板，形成与第一端测序模板链全长互补的多核苷酸链，称为互补链；S3：将第一端测序模板链的3
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端与互补链的5
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端连接，解除第一端测序模板链和互补链的双链杂交结构，并封闭第一端测序模板链，阻止复性环境下互补链与第一端测序模板链重新杂交；S4：加入与互补链的3
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端互补配对的第二测序引物，对互补链的至少部分序列进行测序，获得第二末端序列信息。2.如权利要求1所述的固定化多核苷酸模板配对末端测序方法，其特征在于，步骤S2中形成互补链的具体方法为将完成第一端测序的第一测序引物的延伸多核苷酸链继续以第一端测序模板链为模板延伸，形成与第一端测序模板链全长互补的多核苷酸链作为互补链。3.如权利要求1所述的固定化多核苷酸模板配对末端测序方法，其特征在于，步骤S2中形成互补链的具体方法为，第一测序引物的延伸链与第一端测序模板链解除双链结构，去除第一测序引物的延伸链，加入至少部分与第一端测序模板链的3
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端互补的扩增引物，以第一端测序模板链为模板，延伸扩增引物形成与第一端测序模板链全长互补的多核苷酸链作为互补链。4.如权利要求1～3任一项所述的固定化多核苷酸模板配对末端测序方法，其特征在于，步骤S3中解除第一端测序模板链和互补链的双链杂交结构，并封闭第一端测序模板链的方法为：在变性条件下，第一端测序模板链和互补链解除双链杂交结构，形成长单链，之后加入仅与长单链的第一端测序模板链的3
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端互补配对的第一延伸引物，第一延伸引物以第一端测序模板链为模板延伸形成与第一端测序模板链互补杂交的第一延伸引物链，封闭第一端测序模板链。5.如权利要求4所述的固定化多核苷酸模板配对末端测序方法，其特征在于，步骤S3中还包括在形成长单链之后，加入单链结合蛋白，之后再加入仅与长单链的第一端测序模板链的3
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端互补配对的第一延伸引物。6.如权利要求1～3任一项所述的固定化多核苷酸模板配对末端测序方法，其特征在于，步骤S3中解除第一端测序模板链和互补链的双链杂交结构，并封闭第一端测序模板链的方法为：加入与第一端测序模板链的3
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端互补配对的第二延伸引物，在链置换反应的环境下，第二延伸引物以第一端测序模板链为模板延伸，同时置换出与第一端测序模板链杂交结合的互补链...

【专利技术属性】
技术研发人员：王亚文，王玲玲，孙洁，
申请(专利权)人：郑州思昆生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：