PVRIG基因人源化非人动物的构建方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种人源化PVRIG蛋白、一种人源化PVRIG基因、一种PVRIG基因的靶向载体、一种PVRIG基因人源化的非人动物及其构建方法和其在生物医药领域的应用，利用同源重组的方式将编码人PVRIG蛋白的核苷酸序列导入非人动物基因组中，该动物体内能正常表达人或人源化PVRIG蛋白，可以作为人PVRIG信号机理研究、肿瘤及自身免疫性疾病药物筛选的动物模型，对免疫靶点的新药研发具有重要的应用价值。疫靶点的新药研发具有重要的应用价值。疫靶点的新药研发具有重要的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
PVRIG基因人源化非人动物的构建方法及应用


[0001]本专利技术属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及一种PVRIG基因人源化非人动物的构建方法及其在生物医药领域的应用。

技术介绍

[0002]PVRIG(PVR related immunoglobulin domain containing)又称CD112R，属于脊髓灰质炎病毒受体样蛋白，是一类新出现的具有T细胞共信号功能的IGSF(Ig superfamily，免疫球蛋白超家族)。主要在T细胞和NK细胞中表达。其受体CD112(PVRL2)广泛表达于肿瘤细胞，如急性髓性白血病、多发性骨髓瘤和上皮癌肿瘤细胞。阻断CD112R
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CD112会导致产生IFN
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γ的NK细胞数显著增加，说明阻断PVRIG信号通路能够增强人NK细胞功能。
[0003]目前，对于CD112
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CD112R之间的作用机理及效应有了一些研究，但并不十分清楚。COM701是首个获美国FDA批准进入临床试验的PVRIG抗体。COM701靶向PVRIG能有效刺激某些癌症的肿瘤免疫反应，而且和PD
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1和TIGIT抗体具有协同作用，能够增强T细胞的功能，提高抗肿瘤反应。说明PVRIG可作为新的免疫靶点，单独或与其他靶点联用，用于肿瘤的治疗；
[0004]随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类基因替代或置换动物的同源性基因已经实现，通过这种方式开发人源化实验动物模型是动物模型未来的发展方向。其中基因人源化动物模型，即利用基因编辑技术，用人源正常或突变基因替换动物基因组的同源基因，可建立更接近人类生理或疾病特征的正常或突变基因动物模型。基因人源化动物不但本身具有重要应用价值，如通过基因人源化可改进和提升细胞或组织移植人源化动物模型，更重要的是，由于人类基因片段的插入，动物体内可表达或部分表达人源蛋白，可作为仅能识别人蛋白序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。然而，由于动物与人类在生理学及病理学方面存在差异，加上基因的复杂性，例如，人和小鼠PVRIG蛋白的一致性为39％，如何能构建出“有效”的人源化动物模型用于新药研发仍是最大的挑战。
[0005]鉴于PVRIG复杂的作用机制，以及在肿瘤治疗领域的巨大应用价值，为进一步探索其相关生物学特性，提高临床前期药效试验的有效性，提高研发成功率，使临床前期的试验更有效并使研发失败最小化，本领域急需开发PVRIG相关信号通路的非人动物模型。此外，本方法得到的非人动物还可与其它基因人源化非人动物交配得到多基因人源化动物模型，用于筛选和评估针对该信号通路的人用药及联合用药的药效研究。本专利技术在学术和临床研究中具有广阔的应用前景。

技术实现思路

[0006]本专利技术的第一方面，提供了一种人源化PVRIG蛋白，所述的人源化PVRIG蛋白包含人PVRIG蛋白的全部或部分。
[0007]优选的，所述的人源化PVRIG蛋白包含人PVRIG蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/
或胞质区的全部或部分。
[0008]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的人源化PVRIG蛋白包含人PVRIG蛋白的信号肽和/或胞外区的全部或部分，其中，所述的人源化PVRIG蛋白包含人PVRIG蛋白的胞外区的全部或部分，优选的，包含至少20个连续氨基酸的人PVRIG蛋白胞外区，例如包含至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、131、132、133个连续氨基酸的人PVRIG蛋白胞外区，进一步优选的，包含130个氨基酸的人PVRIG蛋白胞外区；优选的，包含C端去除0
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5(例如0、1、2、3、4、5)个氨基酸的人PVRIG蛋白胞外区，进一步优选的，包含C端去除3个氨基酸的人PVRIG蛋白胞外区；更优选包含SEQ ID NO：2第40
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169或40
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172位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第40
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169或40
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172位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2第40
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169或40
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172位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：2第40
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169或40
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172位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列；所述的人源化PVRIG蛋白包含人PVRIG蛋白信号肽的全部或部分，优选的，包含至少5个连续氨基酸的人PVRIG蛋白信号肽，例如包含至少5、10、11、12、13、14、15、20、30、35、36、37、38、39个氨基酸的人PVRIG蛋白信号肽，进一步优选的，包含39个氨基酸的人PVRIG蛋白信号肽，更优选的，所述的信号肽包含与SEQ ID NO:2的第1
‑
39位具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含SEQ ID NO:2的第1
‑
39位所示氨基酸序列。
[0009]优选的，所述的人源化PVRIG蛋白包含SEQ ID NO：2第1
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169位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第1
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169位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2第1
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169位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：2第1
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169位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
[0010]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的人源化PVRIG蛋白还包含非人动物PVRIG蛋白的全部或部分。优选包含SEQ ID NO：1第164
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234位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：1第164
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234位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：1第164
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234位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：1第164
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234位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
[0011]优选的，所述的人源化PVRIG蛋白包含人PVRIG基因的全部或部分编码的氨基酸序列。
[0012]优选的，所述的人源化PVRIG蛋白包含人本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人源化PVRIG蛋白，其特征在于，所述的人源化PVRIG蛋白包含人PVRIG蛋白的部分。2.根据权利要求1所述的人源化PVRIG蛋白，其特征在于，所述的人源化PVRIG蛋白包含人PVRIG蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分，优选的，所述的人PVRIG蛋白的部分包含人PVRIG蛋白的胞外区的全部或部分，进一步优选的，包含人PVRIG蛋白胞外区至少20个连续氨基酸，优选的，包含SEQ ID NO：2第40
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169或40
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172位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第40
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169或40
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172位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2第40
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169或40
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172位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：2第40
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169或40
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172位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。3.根据权利要求1或2所述的人源化PVRIG蛋白，其特征在于，所述的人源化PVRIG蛋白还包含人PVRIG蛋白的信号肽的全部或部分，优选的，包含人PVRIG蛋白信号肽至少5个连续氨基酸，其中，所述的信号肽包含与SEQ ID NO:2的第1
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39位具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含SEQ ID NO:2的第1
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39位所示氨基酸序列。4.根据权利要求1
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3任一所述的人源化PVRIG蛋白，其特征在于，所述的人源化PVRIG蛋白包含SEQ ID NO：2第1
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169位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第1
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169位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2第1
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169位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：2第1
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169位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列，优选的，所述的人源化PVRIG蛋白还包含非人动物PVRIG蛋白的部分。5.根据权利要求1
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4任一所述的人源化PVRIG蛋白，其特征在于，所述的人源化PVRIG蛋白的氨基酸序列包含下列组中的任一种：A)SEQ ID NO：11所示氨基酸序列；B)与SEQ ID NO：11所示氨基酸序列同一性至少为85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；C)与SEQ ID NO：11所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或D)与SEQ ID NO：11所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。6.一种编码权利要求1
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5任一项所述人源化PVRIG蛋白的核酸。7.一种人源化PVRIG基因，其特征在于，所述的人源化PVRIG基因包含人PVRIG基因的部分。8.根据权利要求7所述的人源化PVRIG基因，其特征在于，所述的人源化PVRIG基因包含人PVRIG基因的1号至6号外显子的全部或部分，优选的，包含2号至4号外显子的全部或部分，进一步优选的，包含2号外显子的部分、3号外显子的全部和4号外显子的部分，其中，2号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，4号外显子的部分至少包含10bp的核苷酸序列。
9.根据权利要求7或8所述的人源化PVRIG基因，其特征在于，所述的人源化PVRIG基因包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。10.根据权利要求7
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9任一所述的人源化PVRIG基因，其特征在于，所述的人源化PVRIG基因还包含非人动物PVRIG基因的全部或部分，进一步优选包含非人动物PVRIG基因的4号至5号外显子的全部或部分，更进一步优选还包含部分1号外显子和/或部分3号外显子的核苷酸序列。11.根据权利要求7
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10任一所述的人源化PVRIG基因，其特征在于，所述的人源化PVRIG基因的核苷酸序列包含下列组中的任一种：A)转录的mRNA为SEQ ID NO：10所示核苷酸序列；B)转录的mRNA与SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的同一性至少为85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；C)转录的mRNA与SEQ ID NO：10所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；D)转录的mRNA具有SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；或，E)包含SEQ ID NO：6和/或7所示的核苷酸序列。12.一种靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包含供体核苷酸序列，优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：A)编码人或人源化PVRIG蛋白的核苷酸序列；B)编码人PVRIG蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人PVRIG蛋白的胞外区和/或信号肽的全部或部分核苷酸序列，进一步优选编码人PVRIG蛋白的胞外区至少20个连续氨基酸的核苷酸序列，更优选的，还包含编码人PVRIG蛋白的信号肽至少5个连续氨基酸的核苷酸序列，更进一步优选的，编码SEQ ID NO：2第1
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169位的核苷酸序列；C)人或人源化PVRIG基因的核苷酸序列；或，D)人PVRIG基因的1号至6号外显子的全部或部分，优选的，人PVRIG基因的2号至4号外显子的全部或部分，进一步优选的，2号外显子的部分、3号外显子的全部和4号外显子的部分，其中，2号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，4号外显子的部分至少包含10bp的...

【专利技术属性】
技术研发人员：张译夫，姚佳维，刘重慧，
申请(专利权)人：百奥赛图北京医药科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：