BnaFANCM基因、应用及获得油菜雄性不育突变体的方法技术

本发明专利技术提供BnaFANCM基因、应用及获得油菜雄性不育突变体的方法，涉及植物基因编辑和植物育种技术领域；本发明专利技术首先获得2个FANCM的同源序列BnaFANCM

【技术实现步骤摘要】
BnaFANCM基因、应用及获得油菜雄性不育突变体的方法


[0001]本专利技术涉及BnaFANCM基因、应用及获得油菜雄性不育突变体的方法，属于植物基因编辑和植物育种


技术介绍

[0002]甘蓝型油菜(Brassica napus L.)属于十字花科、芸薹属，是中国最重要的油料作物之一。甘蓝型油菜原产于欧洲地中海地区，我国约20世纪20年代从日本引进，后来又从欧洲引入原产品种由于我国油菜的栽种历史只有近百年，缺乏优异种质资源，而油菜种质资源是科学研究、品种改良和产业发展不可或缺的物质基础，开展优异种质资源的研究是保障作物新品种不断育成和农业生产可持续发展的重要领域，也是一个国家在作物育种领域核心竞争力的体现。
[0003]目前，我国油菜杂种优势利用的雄性不育系统，主要围绕细胞质雄性不育和细胞核雄性不育系统，但是这2种系统在实际生产应用上均存在一些缺陷；近年来，我国在油菜雄性不育研究领域不断取得新的进展，一些分子标记的开发、育种相关基因的克隆和研究，不断推动油菜雄性不育培育的研究。
[0004]FANCM基因参与减数分裂细胞正常的同源染色体交叉、有丝分裂重组和生育，在拟南芥中，FANCM(哺乳动物Fanconi贫血互补组M的同源物)抑制重组。
[0005]近几年，CRISPR/Cas9(Clustered regulularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR associated)系统是一种能够高效且精准编辑基因组的新兴基因工程技术，目前利用CRISPR/Cas9系统通过对油菜FANCM基因改造尚未有报道。

技术实现思路

[0006]针对现有技术的一些缺点与不足，本专利技术提供一种新的雄性不育油菜种质资源的创制方法；本专利技术还利用CRISPR/Cas9系统对甘蓝型油菜BnaFANCM基因进行定点突变，获得了一种雄性不育的转基因植株。
[0007]为达到上述技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：
[0008]本专利技术首先提供油菜雄性不育相关基因BnaFANCM，所述基因BnaFANCM包括基因BnaFANCM
‑
C05和BnaFANCM
‑
A05，所述BnaFANCM
‑
C05的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.8所示，所述BnaFANCM
‑
A05的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.9所示。
[0009]本专利技术还提供BnaFANCM基因在油菜雄性不育育种中的应用。
[0010]本专利技术还提供一种基因编辑载体pKSE401
‑
BnaFANCM
‑
CRISPR，所述基因编辑载体包含用于甘蓝型油菜BnaFANCM基因编辑的CRISPR/Cas9系统序列元件组，该系统序列包括所述序列元件组包括U6
‑
26p
‑
Target1
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gRNA、U6
‑
26p
‑
Target2
‑
gRNA和根据密码子优化后的Cas9基因以及抗性基因Kana。
[0011]本专利技术中还提供了用于甘蓝型油菜BnaFANCM基因编辑的基因工程菌，所述基因工程菌采用上述基因编辑载体pKSE401
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BnaFANCM
‑
CRISPR转化宿主细菌GV3101得到。
[0012]本专利技术首先提供一种获得油菜雄性不育突变体的方法，所述方法利用CRISPR/Cas9系统对甘蓝型油菜BnaFANCM基因进行编辑，进一步的，所述方法包括：
[0013](1)针对甘蓝型油菜中的BnaFANCM基因序列设计并筛选sgRNA靶点Target1和Target2，所述Target1的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，所述Target2的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示，并合成构建载体所需的引物。
[0014](2)构建双靶点CRISPR/Cas9基因编辑载体：通过PCR扩增以及酶切将2个靶点Target1和Target2分别与sgRNA序列连接，构建出双靶点基因编辑载体pKSE401
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BnaFANCM
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CRISPR。
[0015](3)将pKSE401
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BnaFANCM
‑
CRISPR载体转化农杆菌，获得含有基因编辑表达载体pKSE401
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BnaFANCM
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CRISPR的农杆菌；
[0016](4)利用农杆菌转化的方式将pKSE401
‑
BnaFANCM
‑
CRISPR载体转至受体材料中，经过油菜下胚轴侵染、诱导愈伤组织、再分化、生根培养等步骤获得转基因植株。
[0017]进一步的，为验证所得到的植株为目标植株，在转基因植株中筛选阳性苗植株，利用U626F/R以及Cas9F/R进行扩增鉴定，并通过PCR扩增阳性苗FANCM基因靶点序列并连接T载体送生工生物工程有限公司进行测序，将测序结果进行比对，同时确定编辑形式。
[0018]其中，所述甘蓝型油菜BnaFANCM基因包括BnaFANCM
‑
C05和BnaFANCM
‑
A05，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示，所述Target1、Target2为基因BnaFANCM
‑
C05和BnaFANCM
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A05的共同靶点；
[0019]所述BnaFANCM
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C05的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.8所示，氨基酸序列如SEQ.ID.NO.10所示；
[0020]所述BnaFANCM
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A05的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.9所示，氨基酸序列如SEQ.ID.NO.11所示。
[0021]步骤(1)中所述引物序列如下：
[0022]DT1‑
BsF(SEQ.ID.NO.4)：
[0023]ATATATGGTCTCGATTGAGTCCACACGAATTACTTAGTT
[0024]DT2‑
BsR(SEQ.ID.NO.5)：
[0025]ATTATTGGTCTCGAAACGCTGAACTTTTTGCGACTGCAA
[0026]DT1‑
F0(SEQ.ID.NO.6)：
[0027]TGAGTCCACACGAATTACTTAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
[0028]DT2‑
R0(SEQ.ID.NO.7)：
[0029]AACGCTGAACTTTTTGCGACTGCAATCTCTTAGTCGACTCTAC
[0030]步骤(3)中所述农杆菌为农杆菌GV3101，所述受体材料为Y127。
[0031]本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.油菜雄性不育相关基因BnaFANCM，所述基因BnaFANCM包括基因BnaFANCM
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C05和BnaFANCM
‑
A05，所述BnaFANCM
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C05的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.8所示，所述BnaFANCM
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A05的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.9所示。2.基因BnaFANCM在油菜雄性不育育种中的应用。3.一种基因编辑载体pKSE401
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BnaFANCM
‑
CRISPR，所述基因编辑载体包括BnaFANCM基因序列和BnaFANCM基因编辑的CRISPR/Cas9系统序列元件组，所述系统序列包括所述序列元件组包括U6
‑
26p
‑
Target1
‑
gRNA、U6
‑
26p
‑
Target2
‑
gRNA和根据密码子优化后的Cas9基因以及抗性基因Kana。4.一种基因工程菌，用于BnaFANCM基因定点突变，所述基因工程菌包括权利要求3所述的基因编辑载体pKSE401
‑
BnaFANCM
‑
CRISPR，所述基因工程菌的宿主菌为农杆菌GV3101。5.一种获得油菜雄性不育突变体的方法，其特征在于，所述方法利用CRISPR/Cas9系统对甘蓝型油菜BnaFANCM基因进行编辑。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)针对BnaFANCM基因序列设计并筛选sgRNA靶点Target1和Target2，所述Target1的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，所述Target2的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示，并合成构建载体所需的引物；(2)...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱克明，丁鹏，高月，姜婷，谭小力，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：